Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie
Summary
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.
Abstract
Die Analyse der Zell-Zell oder Zelle-Pathogen Interaktion in Vivo ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Dynamik der Immunantwort auf eine Infektion. Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ermöglicht die Beobachtung des Zell-Interaktionen im tiefen Gewebe in lebenden Tieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz während der Bildaufnahme generiert. Bisher wurden verschiedene Modelle für 2P-IVM der lymphatischen und nicht-lymphatischen Organe beschrieben. Bildgebung der Atmungsorgane bleibt jedoch eine Herausforderung durch die Bewegung der Atemzyklus des Tieres zugeordnet.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur in-Vivo Immunzelle Interaktionen in der Luftröhre von Mäusen mit 2P-IVM mit Influenza-Virus infiziert zu visualisieren. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine benutzerdefinierte Image Plattform, die die chirurgische Exposition und Intubation der Trachea, gefolgt von der Übernahme von dynamischen Bildern von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC) in der Schleimhaut-Epithel enthalten. Darüber hinaus detaillierte wir die notwendigen Schritte zur Grippe intranasale Infektion und Flow durchflusszytometrischen Analyse von Immunzellen in der Luftröhre führen. Zu guter Letzt haben wir Neutrophilen sowie DC Motilität und deren Wechselwirkungen im Laufe eines Films analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht für die Erzeugung von stabilen und helle 4-D-Bilder für die Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen in der Luftröhre.
Introduction
Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ist eine effektive Methode zur Echtzeit imaging von Zell-Zell-Interaktionen, wie sie in ihrer natürlichen Umgebung1vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es die Untersuchung von zellulären Prozessen eine größere Tiefe der Probe (500 µm bis 1 mm ermöglicht) im Vergleich zu anderen herkömmlichen bildgebenden Techniken2. Zum gleichen Zeitpunkt minimiert den Verbrauch von zwei niederenergetischen Photonen durch die zwei-Photonen-Laser erzeugt die Foto-Gewebeschäden in typischer Weise mit dem Bild Erwerb Prozess2verbunden. Während des letzten Jahrzehnts ist 2P-IVM angewendet worden, um verschiedene Arten von Zell-Zell-Interaktionen in mehreren Disziplinen3,4,5zu studieren. Diese Studien wurden besonders relevant zu untersuchen Immunzellen, die sich durch ihre hohe Dynamik und die Bildung von prominenten Kontakte nach erzeugten Signale von anderen Zellen und Umwelt auszeichnen. 2P-IVM wurde auch angewendet, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt6zu studieren. In der Tat hat bisher gezeigt, dass einige Krankheitserreger die Art und Dauer der Kontakte zwischen Immunzellen behindern, infolgedessen die Immunantwort7verändern können.
Die Schleimhaut der Atemwege ist die erste Website, in der die Immunantwort gegen Krankheitserreger in der Luft ist,8erzeugt. In Vivo Analyse der Erreger-Wirt-Interaktionen in diesem Gewebe ist daher entscheidend für die Einleitung der Wirt Abwehrmechanismen während der Infektion zu verstehen. 2 P-IVM der Atemwege ist jedoch anspruchsvoll vor allem durch die Artefakte produziert von den Atemzyklus des Tieres, die den Prozess der Bildaufnahme beeinträchtigt. Vor kurzem wurden verschiedene chirurgische Modelle für bildgebende murinen Luftröhre9,10,11,12 und Lunge13,14,15beschrieben, 16. Trachealen 2P-IVM-Modelle stellen eine ausgezeichnete Einrichtung, die erste Phase der die Immunreaktion in den oberen Atemwegen zu visualisieren, während Lungen-Alveolen 2P-IVM Modelle besser geeignet sind, um der späten Phase der Infektion zu studieren. Die entwickelten Lunge Modelle präsentieren eine Einschränkung verbunden mit der Anwesenheit von luftgefüllten Alveolen, die optische Eindringtiefe des Lasers zu beschränken und die Darmschleimhaut des Hämoglobin Atemwege unzugänglich für in-Vivo imaging17 . Umgekehrt erleichtert die Struktur der Luftröhre, gebildet durch eine kontinuierliche Epithel Bildaufnahme.
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die eine detaillierte Beschreibung der auszuführenden Influenza-Infektion, chirurgische Vorbereitung der Tiere und 2P-IVM der Luftröhre erforderlichen Schritte enthält. Darüber hinaus beschreiben wir eine bestimmte Versuchsanordnung zur Visualisierung von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC), zwei Arten von Immunzellen, die eine wichtige als Vermittler der Abwehrmechanismus gegen Influenza Virus18,19 Rolle . Schließlich beschreiben wir ein Verfahren zur Neutrophilen-DC Interaktionen zu analysieren. Diese Kontakte haben gezeigt, dass DC-Aktivierung zu modulieren und anschließend auf die Immunantwort gegen Krankheitserreger20auswirken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Werk stellt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von 4D Bilder zeigen die Migration der adoptively übertragenen Neutrophilen und ihrer Wechselwirkungen mit DC während einer Influenza-Infektion in der Maus Luftröhre. Die beschriebenen 2P-IVM-Modell werden Immunzelle Dynamik während einer Infektion in den Atemwegen zu studieren.
Vor kurzem, wurden mehrere Modelle basieren auf der Visualisierung von Zelldynamik in den Atemwegen entwickelten9,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Stipendien (176124, 145038 und 148183), der Europäischen Kommission Marie Curie Wiedereingliederungsbeihilfe (612742) und SystemsX.ch nach einer Finanzierungsmöglichkeit für D.U.P (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
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