Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique
Summary
Dans cette étude, nous présentons un protocole pour effectuer deux photons intravitale d’imagerie et de la cellule analyse des interactions dans la muqueuse trachéale murine après infection par le virus de la grippe. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui étudient la dynamique de cellules immunitaires lors d’infections respiratoires.
Abstract
L’analyse de cellule-cellule ou cellule-pathogen interactions in vivo est un outil important pour comprendre la dynamique de la réponse immunitaire à l’infection. Microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) permet l’observation des interactions entre les cellules dans les tissus profonds dans les animaux vivants, tout en minimisant le photoblanchiment généré lors de l’acquisition de l’image. A ce jour, différents modèles pour 2p-IVM des organes lymphoïdes et non lymphoïdes ont été décrits. Toutefois, l’imagerie des organes respiratoires reste un défi en raison de la circulation liée au cycle de respiration de l’animal.
Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser in vivo des cellules immunitaires des interactions dans la trachée chez des souris infectées avec le virus de la grippe à l’aide de 2p-IVM. À cette fin, nous avons développé une plate-forme d’imagerie personnalisée, qui comprenait l’exposition chirurgicale et l’intubation de la trachée, suivie de l’acquisition des images dynamiques des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC) dans l’épithélium muqueux. En outre, nous avons détaillé les étapes nécessaires à l’exercice de la grippe par voie nasale infection et flux analyse cytométrique des cellules immunitaires dans la trachée. Enfin, nous avons analysé les neutrophiles et la motilité DC ainsi que leurs interactions au cours d’un film. Ce protocole permet la génération d’images 4D stable et lumineux nécessaire pour l’évaluation des interactions cellule-cellule dans la trachée.
Introduction
La microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) est une technique efficace pour d’imagerie en temps réel des interactions cellule-cellule lorsqu’ils se produisent dans leur environnement naturel1. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle permet l’étude des processus cellulaires à une plus grande profondeur de l’échantillon (500 µm à 1 mm) par rapport aux autres de techniques d’imagerie traditionnelle2. Dans le même temps, l’utilisation de deux photons de faible énergie générée par le laser à deux photons minimise la photo-lésions tissulaires généralement associées à l’image acquisition processus2. Au cours de la dernière décennie, 2p-IVM a été appliquée à l’étude des différents types d’interactions cellule-cellule dans plusieurs disciplines3,4,5. Ces études ont été particulièrement pertinents pour étudier les cellules immunitaires, qui sont caractérisent par leur dynamisme élevé et la formation d’importants contacts après les signaux générés par les autres cellules et l’environnement. 2P-IVM a été appliquée également pour étudier les interactions entre les pathogènes et hôte6. En effet, il a été précédemment démontré que certains agents pathogènes peuvent modifier le type et la durée des contacts entre les cellules immunitaires, qui entravent, en conséquence, la réponse immunitaire7.
La muqueuse des voies aériennes est le premier site où la réponse immunitaire contre les pathogènes aéroportés est généré8. En vivo analyse des interactions hôte-pathogène dans ce tissu est donc essentielle de comprendre l’initiation des mécanismes de défense de l’hôte au cours de l’infection. Cependant, 2p-IVM des voies respiratoires est difficile, principalement en raison des artefacts produits par le cycle de respiration de l’animal, ce qui compromet le processus d’acquisition d’images. Récemment, différents modèles chirurgicaux ont été décrites pour imagerie trachée murine9,10,11,12 et poumons13,14,15, 16. Trachéale 2p-IVM modèles représentent un excellent montage pour visualiser la phase initiale de la réaction immunitaire dans les voies aériennes supérieures, tandis que les alvéoles pulmonaires 2p-IVM modèles ne conviennent plus étudier la phase tardive des infections. Les modèles développés pulmonaires présentent une limitation associée à la présence d’alvéoles remplies d’air, qui restreignent la pénétration optique du laser et de rendre la muqueuse des voies respiratoires intrapulmonaires inaccessible pour in vivo de l’imagerie17 . À l’inverse, la structure de la trachée, formée par un épithélium continu, facilite l’acquisition d’images.
Nous présentons ici un protocole qui comprend une description détaillée des étapes requises pour effectuer une infection grippale, préparation chirurgicale des animaux et 2p-IVM de la trachée. En outre, les auteurs décrivent un montage expérimental spécifique pour la visualisation des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC), deux types de cellules immunitaires qui jouent un rôle important comme médiateurs du mécanisme de défense contre l’influenza virus18,19 . Enfin, nous décrivons une procédure pour analyser les interactions de neutrophile-DC. Ces contacts auraient dû être divulgués pour moduler l’activation DC et, subséquemment, d’influer sur les réponses immunitaires contre les agents pathogènes20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet ouvrage présente un protocole détaillé pour la génération d’images de 4D montrant la migration des neutrophiles Moutschen transférés et de leurs interactions avec les DC lors d’une infection grippale dans la trachée de souris. Le modèle décrit 2p-IVM sera pertinent d’étudier la dynamique de cellules immunitaires lors d’une infection des voies respiratoires.
Récemment, plusieurs modèles basés sur la visualisation dynamique de cellules dans les voies aériennes ont ét?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation National Suisse (FNS) (176124, 145038 et 148183), la Commission européenne Marie Curie réinsertion Grant (612742) et le SystemsX.ch une subvention pour la D.U.P. (2013/124).
Materials
| Gigasept instru AF | Schülke & Mayr GmbH | 4% solution | |
| CD11c-YFP mice | Jackson Laboratories | 008829 | mice were bred in-house |
| CK6-ECFP mice | Jackson Laboratories | 004218 | mice were bred in-house |
| 1 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D8537-500ML | |
| 10 X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline modified without Calcium Choride and Magnesium Chloride | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Store at 4°C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| Rompun 2% (Xylazin) | Bayer | 6293841.00.00 | Store at RT, store at 4°C when in solution of ket/xyl mixture |
| 26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 G 0,3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 2 mL Syringes | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3 18 G needles | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20G (catheter) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1X) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Store at 4°C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | Store at -20°C / collagenase (I and II) mixture |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Store at -20°C |
| CellTrace Violet stain | ThermoFisher Scientific | C34557 | Store at -20°C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Store at -20°C |
| PE-10 Micro Medical Tubing | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Surgical Plastic Tape | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15mm Round | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Portable Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (gaseous anesthesia and heating bench) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | University of Bern | ||
| TrimScope II Two-photon microscope | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa lasers | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 water immersion objective | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube&The Box incubation chamber and temperature controller | Life imaging Services | ||
| Imaris 9.1.0 | Bitplane | Imaging software | |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | Statistical software |
References
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