哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

哺乳類細胞膜の完全性の損失で、その結果機械、浸透、および生化学的ストレス予告があります。迅速かつ効率的な再封止、なし損傷した細胞プログラムまたは壊死死にすぐに屈する。プロセスを再封止膜を理解する努力は、1960 年代以降、その機能障害に関連付けられている壊滅的な結果によってが動機になっています。確かに、ベイジュ症候群、糖尿病、肢帯型筋ジストロフィーなどの病気は、突然変異遺伝子符号化ジスフェリン、高度の glycation の最終製品の生産や欠陥による欠損細胞膜修復にリンクされています。ライソゾーム人身売買レギュレータ CHS1、それぞれ^1,2,3,4,5,6。しかし、まで、膜の私達の理解を再シールはまだ限られた⁷です。初期の研究は、細胞外 Ca^{2 +}膜破損した^8,9,10までの流入によって膜を再シールを開始することを示しています。その後、いくつか非相互に排他的な Ca^{2 +}の細胞を再シールするのに依存のメカニズムが提案されています。パッチの仮説は、傷口に近接、細胞内小胞がお互いとパッチ^11,12,13,14として破損した細胞膜融合を提案します。2 番目のモデルは、カルシウム依存性の開口放出を提案する傷をリソソームのサイト リリース ライソゾーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンをセラミド細胞膜の外側のリーフレットに変換します。脂質組成の変化は、損傷領域^15,16,17のセラミド駆動エンドサイトーシスの結果します。最後に、3 つめの提案されたメカニズムには、エンドソーム並べ替えを複雑なトランスポート (ESCRT) 膜¹⁸から発芽する外向きの小胞の形成を促進するために必要な役割が含まれます。蛋白質の限定セットのみがこれらのモデルで識別され、その機械をさらに解明する必要があります。

ここ付着性哺乳類細胞における効率を再封止膜が損傷を受けた措置を介する遺伝子組換えリステリオリジン O (LLO)¹⁹高スループット試金を記述します。LLO リステリア菌^20,21,22通性細胞内病原体によって分泌される孔形成毒素 (PFT) を MACPF/CDC に属する (膜の攻撃の複合体、パーフォリンとコレステロール依存性 cytolysin) スーパーファミリー。MACPF は、哺乳類の気孔形成グラム陽性の病原体の病原性ライフ スタイル²³を促進するために宿主細胞に損傷を与えるプロデュース CDCs 主に細菌毒素に対し免疫防御に関与するタンパク質。CDCs は水溶性モノマーとして合成される化や細胞膜に存在コレステロールに結合する二量体まで 50 サブユニットの孔形成前の複合体に oligomerize複雑な prepore は、直径^24,25,,262730-50 nm にわたる β バレル型細孔を形成脂質全体の β ストランドを挿入するのには、再配置します。 これらの大きな毛穴がセルのうちイオンと小型携帯電話部品のフラックスを許可します。しかし、いくつかの研究は、小さいサイズの細孔が形成された^28,29,30も提案しています。CDCs、間 LLO ハイスループット解析^31,32を助長している不可逆的な pH と温度依存性の集計を含む固有のプロパティが表示されます。LLO は 4 ° C、孔複合体の形成ではなく、細胞への結合に許容温度で細胞培養液に追加できます。ポア形成の開始は、細孔生成に関与するフォーム オリゴマーに膜面での毒素分子の効率的な拡散と構造改造を許可する、37 ° C に温度を上げることによって、同期できます。したがって、細胞の損傷の運動、温度スイッチ、次は、細胞膜にバインド毒素の量に依存します。重要なは、水溶性 LLO (細胞膜にはバインドされていない) 迅速かつ不可逆的集約温度 37 ° C、非連結の毒素分子を離れて洗浄する必要性を軽減し、時間をかけて膜損傷の程度を制限に達したとき。最後に、LLO コレステロール バインド コレステロール豊富な膜で毛穴を形作るため、この試金は哺乳類細胞の広い範囲に従う。おいて LLO ホスト細胞の気孔の形成を介して主にシグナル伝達に影響を与えることが重要です間隙に依存しないセルのいくつかの例外を持つシグナルが発生する^{33,34,35,36 ,37,38,39}。したがって、ことはできませんその LLO 活動は細胞膜修復のプロセスに影響を及ぼす信号を除外します。

この試金は直接セル、セル非透過性螢光色素 (例えば、ヨウ化 propidium) 受動的負傷者の細胞に入ると核酸に関連付けられると、高輝度になります定款を測定することにより負傷の程度を評価します。.したがって、螢光色素は細胞を傷つけるのリアルタイム解析をできるように、実験を通して細胞培養培地で維持できます。核酸結合色素の蛍光強度は毒素の濃度が増えるし、毒素の濃度が増加時間をかけてすべての細孔が形成され、細胞は完全に修復されか、飽和に達するまで。細胞外 Ca^{2 +}膜の気孔を通して流入は、再封止かやりイベントです。したがって、resealing の効率が直接判明しない細胞 Ca^{2 +}で負傷する Ca^{2 +} (修理寛容な条件) を含む培地の負傷を比較して-無料媒体 (修理制限条件)。核酸結合色素の蛍光強度は直接各ウェルの細胞濃度に比例しているので、すべての井戸で同じ濃度でシード セルに重要です。また、細胞の剥離が発生しないこと、フローティングとして集計されるセルは、データの解釈を複雑にするかもしれない蛍光測定値を隠すことができるように試験の前後に、各ウェルの細胞を列挙することが重要です。細胞を列挙するには、ローカライズされた核ヒストン 2B GFP (H2B GFP) を発現する細胞は、この試金で使用されました。温度制御、マルチモード マイクロ プレート リーダー迅速、高スループット計測計測を組み合わせる (96 または 384 ウェル プレート フォーマットを使用して) 蛍光強度の 37 ° c. で生きている細胞の顕微鏡イメージングの後者は細胞数を列挙し、異なる細胞集団の最終的な形成を観察に使用できます。

最終的には、この試金はホスト分子のスクリーニングによって膜修復機構の複雑さの彼らの知識を拡大する機能をユーザーに提供または外追加化合物膜を制御する修理します。次のプロトコル LLO 細胞の resealing の効率を測定する実験の手順を説明し、ある薬剤または再シール効率で細胞治療の効果を評価します。