Análisis de ciclo celular en la línea germinal de C. elegans con la EdU de análogo de la timidina

En el desarrollo animal, cientos, miles, millones, miles de millones o incluso billones de divisiones celulares se requieren para formar el organismo adulto. El ciclo celular, el conjunto de eventos celulares por G1 (gap), S (síntesis), G2 (gap), y M (mitosis) definir la serie de eventos que son ejecutaron cada división celular. El ciclo celular es dinámica y mejor apreciado en tiempo real, que puede ser técnicamente difícil. Las técnicas presentadas en este protocolo permiten hacer las mediciones de las fases y tiempos del ciclo celular de imágenes fijas.

Etiquetado con análogos de nucleósidos como 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) o 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) es el estándar de oro para identificar la fase S en los estudios de la dinámica del ciclo celular en el adulto de Caenorhabditis elegans (C. elegans) hermafroditas del germline^1,2,3,4,5. EdU y BrdU pueden utilizarse en casi cualquier fondo genético, como no dependen de ningún concepto genética. Visualización de BrdU requiere tratamiento químico áspero para exponer el antígeno para el anticuerpo anti-BrdU de tinción, que a menudo es incompatible con la evaluación de otros marcadores celulares visualizadas mediante tinción con anticuerpos adicionales conjuntamente. Por el contrario, visualizar EdU se produce por la química del tecleo condiciones suaves y por lo tanto es compatible con el anticuerpo Co manchas^6,7.

La especificidad de la etiqueta es clara, puesto que los núcleos sólo incorporan los análogos de timidina (5-ethynyl-2′-desoxiuridina) ADN durante la fase S. Visualización lleva a cabo en tejido fijo. La etiqueta de EdU es invisible por sí mismo hasta un colorante que contiene azida o fluoróforo covalente reacciona con el alquino en EdU de química cobre-catalizada del tecleo⁸. Etiquetado EdU puede proporcionar información inmediata en la que los núcleos son en fase S, mediante un breve impulso de etiquetado. EdU también puede proporcionar información dinámica, mediante pulso-persiga o etiquetas de continuo; por ejemplo, en un experimento de Pulso-persiga, la etiqueta se diluye en cada división celular o reproducidos como nondividing progreso de células a través del desarrollo.

El germline hermafrodita C. elegans es un sistema potente para los estudios de señalización de vías, las células madre, meiosis y ciclo celular. El germline adulto es una línea de ensamblaje polarizada con células madre en el extremo distal, seguido por la entrada y la progresión a través de la profase meiótica, coordinado con las etapas de la gametogénesis más proximal (figura 1). En el extremo proximal, ovocitos maduran, son ovularon y fertilizan y comienzan la embriogénesis en el útero^9,10,11. La región larga de ~ 20 células de diámetro cerca de la célula de la punta distal, que incluye el vástago del germline mitotically ciclismo, células progenitoras y células en fase S meióticas pero no las células en profase meiótica, se llama el progenitor zona^{2,4 , 9 , 12}. las membranas celulares proporcionan separación incompleta entre los núcleos en el germline distal, pero las células de la zona de progenitoras se someten a ciclismo en gran parte independientemente de la célula mitótica. La duración mediana ciclo celular mitótico de las células de zona de progenitor del germline en jóvenes adultos hermafroditas es ~6.5 h; Fase G1 es breve o ausente, y quietud no se observa^1,2,13. Diferenciación de la célula de vástago del germline se produce a través de la diferenciación esencialmente directa y carece así de tránsito amplificando las divisiones⁴. Durante la diferenciación en la fase de paquiteno, aproximadamente 4 de cada 5 núcleos no forma ovocitos pero en cambio sufren apoptosis, actuando como enfermera células donando su contenido citoplasmático al ovocito en desarrollo^{12,14 , 15}.

Además de etiquetado células en fase S con análogos de nucleósidos, uno puede identificar las células en mitosis y meiosis utilizando anticuerpos. Núcleo en la mitosis es inmunorreactivas para anti-phospho-histona H3 (Ser10) anticuerpo (llamado pH3)^7,16. Los núcleos en la meiosis son immunoreactive a los anticuerpos anti-lo-3 (una proteína del eje del cromosoma meiótico)¹⁷. Núcleos en la zona del progenitor pueden identificarse por la ausencia de él-3, la presencia de nucleoplasmática REC-8¹⁸o la presencia de WAPL-1¹⁹. WAPL-1 intensidad es más alta en la gónada somática, alta en la zona de la progenitora y baja durante temprano meiótica prophases¹⁹. Varias mediciones de ciclo celular son posibles con algunas variaciones en el protocolo: I) identificar los núcleos en fase S y medir el índice de la fase S; II) identificar los núcleos en fase M y medir el índice de fase M; III) determinar si los núcleos estaban en S-fase mitótica o meiótica; IV) medir la duración de G2; V) medir la duración de las fases G2 + M + G1; VI) medir la velocidad de entrada meiótica; VII) estiman la tasa de progresión meiótica.

Uno puede hacer múltiples mediciones de ciclo celular de sólo algunos tipos de experimentos de laboratorio húmedo. El protocolo a continuación describe un etiquetado de pulso de 30 min por la alimentación de C. elegans adultos hermafroditas con EdU etiquetado como bacterias y células en fase M Co etiquetadas mediante tinción con el progenitor y el anticuerpo anti-pH3 las células de la zona mediante tinción con anticuerpos anti-WAPL-1. Sólo cambios en la duración de EdU de la alimentación (paso 2.5), tipo de anticuerpos emplean (paso 5), y análisis (8,3 de paso) son necesarios para las mediciones adicionales.