Анализ клеточного цикла в C. elegans микрофлорой с EdU аналог тимидина

В развития животных сотни, тысячи, миллионы, миллиарды или даже триллионы клеток подразделений обязаны сформировать взрослого организма. Клеточный цикл, набор событий, клеточном составе G1 (ГАП), S (синтез), G2 (ГАП), и M (митоз) определить ряд событий, которые выполняются каждое деление клеток. Клеточный цикл является динамичной и лучше всего ценится в режиме реального времени, которое может быть технически сложным. Методы, представленные в настоящем Протоколе позволяют сделать измерения этапов и сроков клеточного цикла из неподвижных изображений.

Маркировка с Нуклеозидные аналоги, такие как 5-ethynyl-2′-дезоксиуридина (EdU) или 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) является золотым стандартом для определения S-фазы в исследованиях динамики клеточного цикла в взрослого Caenorhabditis elegans (C. elegans) Гермафродит микрофлорой^1,2,3,4,5. Эду и BrdU может использоваться в почти любой генетический фон, как они не полагаются на любом генетические конструкции. Визуализация BrdU требует суровых химической обработки подвергать антигена антитела анти BrdU окрашивание, которое часто является несовместимым с оценки других клеточных маркеров визуализированы пятнать совместно с дополнительные антитела. Напротив визуализации EdU происходит по химии нажмите мягкая условиях и таким образом совместим с антителом, совместно пятнать^6,7.

Специфика метки ясно, поскольку ядер только учесть аналогов (5-ethynyl-2′-дезоксиуридина) тимидина ДНК в S-фазе. Визуализация занимает место в фиксированных тканей. EdU метка невидимым сама по себе вплоть до азид содержащих красителя или Флюорофор ковалентно реагирует с алкины в EdU медь катализируемого нажмите химия⁸. EdU маркировки может обеспечить немедленное информацию, на которой ядра находятся в S-фазе, с помощью короткого импульса маркировки. EdU может также обеспечить динамическую информацию, с помощью импульса Чейз или непрерывной маркировки; например в эксперименте пульс Чейз, метка разбавляется на каждое деление клеток или распространяются как nondividing клетки прогресс через развитие.

Гермафродит микрофлорой C. elegans является мощной модели системы для исследования сигнальные пути, стволовые клетки, мейоз и клеточного цикла. Взрослый микрофлорой является поляризованной конвейера с помощью стволовых клеток найдены на дистальном конце следуют вход и прогрессии через meiotic профаза, координироваться с этапами гаметогенеза более проксимально (рис. 1). В проксимальном конце ооциты Зрелые, являются овуляция и оплодотворенной и начать эмбриогенеза в матку^9,10,11. ~ 20 клеток диаметр длинные районе дистального наконечника ячейка, которая включает в себя mitotically Велоспорт стволовых микрофлорой, клетки-предшественники и meiotic клетки в S-фазе, но не для ячейки в meiotic профаза, называют прародителем зоны^{2,4 , 9 , 12}. клеточные мембраны обеспечивают неполного разделения между ядрами в дистальной микрофлорой, но прародитель зоны клетки претерпевают митотическая клеток, Велоспорт в основном самостоятельно. Средний митотический клеточный цикл продолжительность микрофлорой клетки-предшественники зоны в молодых взрослых гермафродитки составляет ~6.5 ч; G1 фазе краткие или отсутствует, и покоя не наблюдается^1,2,13. Микрофлорой дифференцировки стволовых клеток происходит через по существу прямым дифференциации и таким образом не хватает транзит усилительных дивизий⁴. Во время дифференциации в стадии pachytene примерно 4 из 5 ядер не образуют яйцеклеток, но вместо этого проходят apoptosis, действуя как медсестра клетки, жертвуя их цитоплазматических содержимое для развивающихся ооцитов^{12,14 , 15}.

В дополнение к маркировке клетки в S-фазе с аналогами нуклеозидов можно определить клетки митоз и мейоз, используя Пятнать антитела. Ядер в митозе иммунореактивных к анти фосфо гистонов H3 (Ser10) антитела (так называемый pH3)^7,16. Ядра в мейоз иммунореактивных антитела анти его-3 (белок оси meiotic хромосома)¹⁷. Ядер в зоне прародитель может быть идентифицирован отсутствие HIM-3, наличие nucleoplasmic REC-8¹⁸или наличие WAPL-1¹⁹. Интенсивность WAPL-1 является высоким в соматической гонад, высокий в зоне прародителю и низкой во время ранних meiotic prophases¹⁹. Несколько клеточного цикла измерения возможны несколько вариантов в протоколе: я) определить ядер в S-фазе и измерения индекс S-фазе; II) M-фаза идентификации ядер и измерения индекс М-фаза; III) определяет, были ли ядер митотическая или meiotic S-фазе; IV) измерить продолжительность G2; V) измерить течении G2 + M + G1 фаз; VI) измерить скорость meiotic въезда; VII) оцените meiotic прогрессии.

Можно сделать несколько клеточного цикла измерений от лишь нескольких видов мокрой лабораторных экспериментов. Протокол ниже описывает 30 мин пульс маркировки кормления C. elegans взрослых гермафродитки с EdU помечены бактерии и совместной маркировки M-фаза клетки путем пятнать с анти pH3 антитела и прогениторных клеток зоны путем пятнать антитела анти WAPL-1. Анализы (шаг 8.3) требуются для дополнительных измерений, и только изменения в продолжительности EdU корма (шаг 2.5), тип антител занятых (шаг 5).