Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

No desenvolvimento do animal, centenas, milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de divisões celulares são necessários para formar o organismo adulto. O ciclo celular, o conjunto de eventos celulares compostas de G1 (gap), S (síntese), G2 (gap), e M (mitose) definir a série de eventos que são executados a cada divisão celular. O ciclo celular é dinâmico e melhor apreciada em tempo real, que pode ser tecnicamente difícil. As técnicas apresentadas neste protocolo permitem que se faça as medições das fases e o ciclo celular de imagens fixas.

Rotulagem com análogos de nucleosídeos como 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) ou 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) é o padrão-ouro para identificar a fase S nos estudos de dinâmica do ciclo celular no adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline hermafrodita^1,2,3,4,5. EdU e BrdU tanto podem ser usado em quase qualquer fundo genético, como eles não dependem de qualquer construção genética. Visualizar BrdU requer tratamento químico áspero para expor o antígeno para o anticorpo anti-BrdU coloração, que muitas vezes é incompatível com a avaliação de outros marcadores celulares visualizados por coloração com anticorpos adicionais de co. Em contrapartida, Visualizar o EdU ocorre pela química clique em condições suaves e, portanto, é compatível com o anticorpo que mancha co^6,7.

A especificidade do rótulo é clara, desde que os núcleos só incorporam os análogos (5-ethynyl-2′-desoxiuridina) de timidina DNA durante a fase S. Visualização ocorre no tecido fixo. O rótulo de EdU é invisível por si só até um corante contendo azida sódica ou fluoróforo covalentemente reage com o alkyne em EdU por clique cobre-catalisada química⁸. EdU rotulagem pode fornecer informação imediata, na qual os núcleos estão em fase S, usando um curto pulso de rotulagem. EdU também pode fornecer informações dinâmicas, usando o pulso-chase ou rotulagem contínua; por exemplo, em um experimento de pulso-perseguição, o rótulo é diluído em cada divisão celular ou propagadas como nondividing de células de progresso através de desenvolvimento.

O germline hermafrodita de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose. O adulto germline é uma linha de montagem polarizada com células-tronco encontradas na extremidade distal, seguida por entrada e progressão através da prófase meiótica, coordenado com as fases da gametogênese mais proximal (Figura 1). Na extremidade proximal, oócitos maduros, são ovularam e fertilizados e começam a embriogênese na útero^9,10,11. A região de ~ 20 célula-diâmetro longo perto da célula de ponta distal, que inclui o tronco germline mitotically ciclismo, células progenitoras e meiose células em fase S, mas não as células na prófase meiótica, chama-se o progenitor zona^{2,4 , 9 , 12}. as membranas celulares fornecem separação incompleta entre os núcleos no germline distal, mas células progenitoras zona passam por célula mitótica ciclismo em grande parte independente. A duração do ciclo de celular mitótica mediana do germline progenitoras de zona em jovens adultas hermafroditas é ~6.5 h; Fase G1 é curto ou ausente, e quiescência não é observada^1,2,13. Diferenciação de células-tronco do germline ocorre através da modulação essencialmente direta e, portanto, carece de trânsito-amplificando divisões⁴. Durante a diferenciação na fase de paquíteno, aproximadamente 4 em 5 núcleos não formará oócitos, mas em vez disso, passam por apoptose, atuando como enfermeira células doando seu conteúdo citoplasmático para o desenvolvimento oócito^{12,14 , 15}.

Além de rotulagem células em fase S com análogos de nucleosídeos, pode-se identificar as células em mitose e meiose usando anticorpos. Núcleos em mitose são imunorreativas para antifosfo-histona H3 (Ser10) Anticorpo (chamado pH3)^7,16. Núcleos na meiose são imunorreativas para anticorpo antiele-3 (uma proteína de eixo de cromossomas)¹⁷. Núcleos na zona de progenitor podem ser identificados pela ausência de HIM-3, a presença de auxílio REC-8,¹⁸ou a presença de WAPL-1¹⁹. WAPL-1 intensidade é maior na gônada somática, alta na zona de progenitor e baixa durante cedo meiótica prophases¹⁹. Várias medições de ciclo celular são possíveis, com algumas variações no protocolo: eu) identificar os núcleos na fase S e medir o índice de fase S; II) identificar núcleos em M-fase e medir o índice de M-fase; III) determinar se núcleos em S-fase mitótica ou meiótica; IV) medir a duração do G2; V) medir o duartion das fases G1 + G2 + M; VI) medir a taxa de entrada meiótica; VII) estimativa da taxa de progressão meiótica.

Pode-se fazer várias medições de ciclo celular de apenas alguns tipos de experimentos de laboratório-molhado. O protocolo abaixo descreve uma rotulagem de pulso de 30 min por alimentação c. elegans adultas hermafroditas com EdU rotulado de bactérias e células em fase M co rotulagem pela coloração com o progenitor e anticorpo anti-pH3 células zona por coloração com anticorpos anti-WAPL-1. Somente as alterações na duração do EdU alimentar (etapa 2.5), tipo de anticorpos empregados (etapa 5), e análises (passo 8.3) são necessárias para as medições adicionais.