Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

Nello sviluppo animale, centinaia, migliaia, milioni, miliardi o anche migliaia di miliardi di divisioni cellulari è necessari per formare l’organismo adulto. Il ciclo cellulare, il set di eventi cellulari composto di G1 (gap), S (sintesi), G2 (gap), e M (mitosi) definire la serie di eventi che vengono eseguiti ogni divisione cellulare. Il ciclo cellulare è dinamico e meglio apprezzato in tempo reale, che può essere tecnicamente difficile. Le tecniche presentate in questo protocollo permettono di effettuare le misurazioni delle fasi e la tempistica del ciclo cellulare da immagini fisse.

Etichettatura con analoghi nucleosidici come 5-Etinil-2′-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) è il gold standard per identificare la fase S negli studi della dinamica del ciclo cellulare nell’adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline ermafroditi^1,2,3,4,5. EdU sia BrdU utilizzabile in quasi qualsiasi background genetico, come che non si basano su qualsiasi costrutto genetico. Visualizzazione di BrdU richiede duro trattamento chimico per esporre l’antigene per l’anticorpo anti-BrdU colorazione, che spesso è incompatibile con la valutazione di altri markers cellulari visualizzati dalla co-macchiatura con altri anticorpi. Al contrario, visualizzazione EdU si verifica dalla chimica clicca in condizioni blande e quindi è compatibile con l’anticorpo co-macchiatura^6,7.

La specificità dell’etichetta è chiara, dal momento che i nuclei solo incorporano gli analoghi (5-Etinil-2′-deoxyuridine) della timidina in DNA durante la fase S. Visualizzazione avviene nel tessuto fisso. L’etichetta di EdU è invisibile da solo fino a un colorante contenenti azide o fluorophore reagisce covalentemente con alchini in EdU di rame-catalizzata clic chimica⁸. EdU etichettatura può fornire informazioni immediate su cui i nuclei sono in fase S, utilizzando un breve impulso di etichettatura. EdU possono anche fornire informazioni dinamiche, utilizzando pulse-chase o etichettatura continuo; ad esempio, in un esperimento di pulse-chase, l’etichetta è diluita a ogni divisione cellulare o propagate come nondividing cellule progresso attraverso lo sviluppo.

C. elegans ermafrodita germinale è un sistema potente modello per gli studi del ciclo cellulare, cellule staminali, meiosi e vie di segnalazione. La linea germinale adulta è una linea di assemblaggio polarizzata con cellule staminali presenti all’estremità distale, seguita da voce e progressione attraverso Profase Meiotica, coordinato con le fasi della gametogenesi più prossimalmente (Figura 1). L’estremità prossimale, ovociti maturo, sono ovulati e fertilizzato e cominciano l’embriogenesi nel utero^9,10,11. La regione lungo ~ 20 cella-diametro accanto alla cella di punta distale, che include il gambo di germline mitotically ciclismo, cellule progenitrici e le cellule di S-fase meiotiche ma non le cellule in Profase Meiotica, viene chiamata il progenitore zona^{2,4 , 9 , 12}. le membrane delle cellule forniscono incompleta separazione tra i nuclei la linea germinale distale, ma la zona cellule progenitrici subiscono mitotica cellulare ciclismo in gran parte in modo indipendente. La durata mediana ciclo cellulare mitotica delle cellule di zona progenitrici di germline in giovane adulti ermafroditi è ~6.5 h; Fase G1 è breve o assente, e quiescenza non è osservato^1,2,13. Differenziazione delle cellule staminali germinali si verifica attraverso la differenziazione essenzialmente diretta e quindi manca di transito-amplificando divisioni⁴. Durante la differenziazione nel pachitene, circa 4 su 5 nuclei non si formano gli ovociti ma invece andare incontro ad apoptosi, in qualità di infermiera cellule donando loro contenuto citoplasmatico di sviluppo dell’ovocita^{12,14 , 15}.

Oltre alle etichette cellule in fase S con analoghi nucleosidici, si possono identificare le cellule in mitosi e meiosi usando la macchiatura dell’anticorpo. Nuclei in mitosi sono immunoreactive all’anti-fosfo-istone H3 (Ser10) anticorpo (chiamato pH3)^7,16. Nuclei in meiosi sono immunoreactive all’anticorpo anti-lui-3 (una proteina di asse meiotic del cromosoma)¹⁷. I nuclei nella zona del progenitore possono essere identificati dall’assenza di HIM-3, la presenza di adrenocorticale REC-8¹⁸o la presenza di WAPL-1¹⁹. WAPL-1 intensità è massima nella gonade somatica, alta nella zona del progenitore e basso durante i primi meiotica prophases¹⁹. Diverse misurazioni del ciclo cellulare sono possibili con poche variazioni nel protocollo: I) identificare i nuclei in fase S e misurare l’indice di S-fase; II) identificare i nuclei in fase M e misurare l’indice di fase M; III) determinano se i nuclei erano nella S-fase mitotica o meiotica; IV) misurare la durata di G2; V) misura la duartion delle fasi G1 + G2 + M; VI) misura il tasso di entrata meiotica; VII) stimare il tasso di progressione meiotica.

Si possono fare misurazioni multiple del ciclo cellulare da solo alcuni tipi di esperimenti di laboratorio bagnato. Il protocollo sottostante descrive un 30 min impulso etichettatura alimentandosi di c. elegans adulti ermafroditi con EdU etichettato batteri e cellule co-etichettatura di M-fase macchiando con progenitore e degli anticorpi anti-pH3 zona cellule macchiando con anticorpo anti-WAPL-1. Soltanto i cambiamenti nella durata della EdU feed (punto 2.5), tipo di anticorpi impiegati (punto 5), e sono necessarie per le misure ulteriori analisi (punto 8.3).