ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין
Summary
שיטה מבוססת הדמיה מתואר כי ניתן להשתמש כדי לזהות שלב S ולנתח מחזור התא דינמיקה ב germline אנדרוגינוס C. elegans באמצעות של תימידין אדו אנלוגי. שיטה זו דורשת לא transgenes והוא תואם עם immunofluorescent מכתים.
Abstract
ניתוח מחזור התא פרוקריוטים מנצל לעתים קרובות כרומוזום מורפולוגיה, ביטוי ו/או לוקליזציה של ג’ין המוצרים הנדרשים עבור שלבים שונים של מחזור התא, או שילוב של תחליפי nucleoside. במהלך שלב זה, ה-DNA polymerases לשלב תימידין תחליפי כגון EdU או BrdU בהכפלת ה-DNA, לסמן את התאים עבור ניתוח. עבור C. elegans, nucleoside אדו אנלוגית היא שתתה את התולעים במהלך תרבות קבוע והוא תואם עם טכניקות immunofluorescent. Germline של C. elegans היא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא כי זה שקוף, נתיישב גנטית, meiotic prophase, בידול הסלולר/gametogenesis מתרחשים הרכבה דמוי ליניארי. תכונות אלה להפוך אדו כלי נהדר ללמוד היבטים דינמיים של תאים mitotically אופניים ופיתוח germline. פרוטוקול זה מתאר את אופן בהצלחה להכין חיידקים אדו, להאכיל בהם פראי-סוג C. elegans אנדרוגינוסים, לנתח את בלוטת המין אנדרוגינוס, כתם על התאגדות אדו לתוך ה-DNA, כתם עם נוגדנים כדי לזהות את מחזור התא השונים, סמנים התפתחותית, תמונה של בלוטת המין ולנתח את התוצאות. הפרוטוקול מתאר הווריאציות שיטת וניתוח לשקילת S-פאזי אינדקס, M-פאזי אינדקס, G2, משך מחזור התא, בקצב חדירה meiotic ומשך קצב התקדמות meiotic prophase. בשיטה זו ניתן להתאים כדי ללמוד על מחזור התא או היסטוריה תא אחרים רקמות, שלבים, רקע גנטי והתנאים פיזיולוגיים.
Introduction
התפתחות בעלי חיים, מאות, אלפים, מיליונים, ביליונים או אפילו. טריליוני חלוקות תאים נדרשים כדי ליצור האורגניזם למבוגרים. מחזור התא, קבוצת הסלולר אירועים מורכב G1 (מרווח), S (סינתזה), G2 (מרווח), M (מיטוזה) מגדירים את סדרת אירועים להורג כל חלוקת התא. מחזור התא הוא דינמי ומוערכת ביותר בזמן אמת, אשר יכול להיות קשה מבחינה טכנית. טכניקות הוצג פרוטוקול זה מאפשר אחד להפוך את המידות של השלבים והתזמון של מחזור התא מתמונות סטילס.
תיוג עם תחליפי nucleoside כגון 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (אדו) או 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU) הוא תקן זהב כדי לזהות שלב S במחקרים של מחזור התא דינאמיקה של מבוגר Caenorhabditis elegans (C. elegans) אנדרוגינוס germline1,2,3,4,5. עידו והן BrdU יכול לשמש כמעט כל רקע גנטי, הם אינם סומכים על כל מבנה גנטי. להמחיש BrdU דורש טיפול כימי קשה לחשוף אנטיגן של נוגדן anti-BrdU מכתים, אשר לעתים קרובות אינו תואם ההערכה של סמנים אחרים התאית דמיינו ידי מכתימה במשותף עם נוגדנים נוספים. לעומת זאת, להמחיש אדו מתרחשת על ידי לחץ כימיה בתנאים מתון, ובכך הוא תואם עם נוגדן משותפת מכתים6,7.
ייחודה של התווית ברור, מאז גרעינים לשלב רק אנלוגים (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) תימידין לתוך ה-DNA במהלך שלב S. ויזואליזציה מתקיים בתוך הרקמה קבוע. התווית אדו הוא בלתי נראה בפני עצמו עד אזיד המכילים צבען או fluorophore מגיב covalently אלקין באדו על ידי לחץ מזורז נחושת כימיה8. עידו תיוג יכול לספק מידע מיידי שבו הגרעינים הם שלב S, באמצעות דופק קצר של תיוג. EdU יכולים גם לספק מידע דינמי, באמצעות הדופק. צ’ייס או תיוג רציפה; לדוגמה, בניסוי דופק. צ’ייס, התווית הוא מדולל-כל חלוקת התא או הופץ תאים כמו nondividing, ההתקדמות בפיתוח.
Germline אנדרוגינוס C. elegans הוא מערכת מודל רב עוצמה עבור הלימודים של איתות המסלולים, תאי גזע, מיוזה, מחזור התא. Germline למבוגרים הוא קו הרכבה מקוטב עם תאי גזע בקצה הדיסטלי ואחריו ערך וההתקדמות דרך prophase meiotic, בתיאום עם השלבים של gametogenesis יותר הציר הקרוב (איור 1). בסוף צינתור, oocytes מבוגרים, הם ovulated, מופרית ולהתחיל מופרה הרחם9,10,11. אזור זמן ~ 20 תא-קוטר ליד התא עצה הדיסטלי, אשר כולל הגבעול germline mitotically אופניים, ובתאים תאים S-שלב meiotic אבל לא התאים meiotic prophase, נקרא קדמון אזור2,4 , 9 , 12. קרום התא לספק הפרדה לא שלם בין האטומים ב germline דיסטלי, אבל אזור ובתאים עוברים תא mitotic רכיבה על אופניים במידה רבה באופן עצמאי. משך מחזור התא mitotic החציוני germline ובתאים אזור של אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים הוא ~6.5 h; שלב G1 הוא קצר או נעדר, ואת תרדמה לא נצפית1,2,13. התמיינות תאי גזע Germline מתרחשת דרך בידול ישיר במהותו, ובכך חסרה הגברה-טרנזיט חטיבות4. במהלך התמיינות בשלב pachytene, כ 4 מתוך 5 גרעינים לא יהוו oocytes אך במקום עוברים אפופטוזיס, מתנהג כמו האחות תאים על-ידי תרומת התוכן cytoplasmic שלהם כדי מתפתח oocyte12,14 , 15.
בנוסף תאי תיוג בשלב-S עם תחליפי nucleoside, ניתן לזהות את התאים מיטוזה, מיוזה באמצעות נוגדן מכתים. גרעינים של מיטוזה הם immunoreactive ל H3 אנטי-פוספו-היסטון7,(Ser10) נוגדנים (נקרא pH3)16. גרעינים של מיוזה הם immunoreactive נוגדן anti-לו-3 (ציר כרומוזום meiotic חלבון)17. הגרעינים באזור קדמון יכול להיות מזוהה על ידי העדר לו-3, הנוכחות של REC-8 nucleoplasmic18או הנוכחות של WAPL-119. WAPL-1 עוצמת הוא הגבוה ביותר בלוטת המין הסומטית, גבוה באזור ‘ קדמון ‘, ונמוך במהלך המוקדמות meiotic prophases19. מדידות מחזור התא מספר אפשריות עם כמה וריאציות של הפרוטוקול: אני) לזהות את הגרעינים בשלב-S ולמדוד את מדד S-שלב; II) לזהות את הגרעינים בשלב-M ולמדוד את האינדקס M-שלב; III) לקבוע אם הגרעינים היו בשלב mitotic או meiotic S; IV) למדוד את משך G2; V) מודד duartion G2 + M + G1 שלבים; VI) למדוד את קצב הכניסה meiotic; VII) הערכת קצב התקדמות meiotic.
אפשר להכין מספר מידות מחזור התא רק כמה סוגי רטוב-מעבדת ניסויים. להלן הפרוטוקול מתאר של תיוג דופק 30 דקות על ידי האכלה C. elegans אנדרוגינוסים למבוגרים עם עידו שכותרתו חיידקים ותאים M-פאזי תיוג במשותף על ידי צביעת עם נוגדן anti-pH3 ו קדמון אזור תאים על ידי צביעת עם נוגדן anti-WAPL-1. שינויים רק משך הזמן של עידו להאכיל (שלב 2.5), סוג של נוגדנים המועסקים (שלב 5) ולאחר ניתוחים (שלב 8.3) נדרשים עבור המדידות נוספים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנה של חיידקים התווית על-ידי אדו (שלב 1) היא קריטית עבור פרוטוקול זה, ואת הנקודה הראשונה לפתרון. אנדרוגינוסים למבוגרים צעירים פראי-סוג תווית בצורה אמינה במיוחד ב ה 4 אדו-דופק, שהופך את פקד שימושי עבור כל אצווה חדשה של חיידקים התווית על-ידי אדו. בנוסף, חיידקים התווית על-ידי עידו ללא פגע מזין את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו מודים למרכז מניות של e. coli MG1693; Wormbase; המרכז גנטיקה Caenorhabditis אשר ממומן על ידי נבחרת מוסדות של בריאות של מחקר תשתית בתוכניות Office (P40OD010440) עבור זנים; זאק פינקוס לייעוץ סטטיסטי; פנג Aiping עבור ריאגנטים; לוק שניידר, אנדריאה שרף, סנדיפ קומאר, ג’ון ברנר עבור הדרכה, ייעוץ, תמיכה דיון מועיל; המעבדות קורנפלד, Schedl למשוב על כתב היד הזה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R01 AG02656106A1 כדי KK, R01 GM100756 ל TS], מלגת predoctoral הלאומית למדע [DGE-1143954 ו DGE-1745038 כדי ZK]. מכוני הבריאות הלאומיים וגם הקרן הלאומית למדע היה כל תפקיד בעיצוב של המחקר, איסוף, ניתוח ופרשנות של נתונים, ולא בכתב היד.
Materials
| E. coli MG1693 | Coli Genetic Stock Center | 6411 | grows fine in standard unsupplemented LB |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | Sigma | 900584-50MG | or use EdU provided in kit |
| Glucose | Sigma | D9434-500G | D-(+)-Dextrose |
| Thiamine (Vitamin B1) | Sigma | T4625-5G | Reagent Grade |
| Thymidine | Sigma | T1895-1G | BioReagent |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M1880-1KG | MgSO4, Reagent Grade |
| Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous | Fisher | BP332-500G | Na2HPO4 |
| Potassium Phosphate, monobasic | Sigma | P5379-500G | KH2PO4 |
| Ammonium Chloride | Sigma | A4514-500G | NH4Cl, Reagent Plus |
| Bacteriological Agar | US Biological | C13071058 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Sigma | C3881-500G | CaCl |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522-1KG | Used at 25g/L |
| Levamisole | Sigma | L9756-5G | 0.241g/10ml |
| Phosphate buffered saline | Calbiochem Omnipur | 6506 | homemade PBS works just as well |
| Tween-20 | Sigma | P1379-500ML | |
| 16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10ml ampules |
| 100% methanol | Thermo Fisher Scientific | A454-1L | Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | Lot 1671330 |
| rabbit-anti-WAPL-1 | Novus biologicals | 49300002 | Lot G3048-179A02, used at 1:2000 |
| mouse-anti-pH3 clone 3H10 | Millipore | 05-806 | Lot#2680533, used at 1:500 |
| goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | Lot 1256147, used at 1:400 |
| goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Lot 1511347, used at 1:400 |
| Vectashield antifade mounting medium containing 4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation |
| nail polish | Wet n Wild | DTC450B | any clear nail polish should work |
| S-medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 buffer | various | see wormbook.org for protocol | |
| M9 agar | various | same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar | |
| Nematode Growth Medium | various | see wormbook.org for protocol | |
| dissecting watch glass | Carolina Biological | 42300 | |
| Parafilm laboratory film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | 4 inch wide laboratory film |
| petri dishes | 60 mm diameter | ||
| Long glass Pasteur pipettes | |||
| 1ml centrifuge tubes | MidSci Avant | 2926 | |
| Tips | |||
| Serological pipettes | |||
| 500 mL Erlenmyer flask | |||
| Aluminum foil | |||
| 25G 5/8” needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| 5ml glass centrifuge tube | Pyrex | ||
| Borosilicate glass tubes 1ml | |||
| glass slides | |||
| no 1 coverslips 22 x 40 mm | no 1.5 may work, also | ||
| 37 °C Shaker incubator | |||
| Tabletop Centrifuge | |||
| Clinical Centrifuge | IEC | 428 | with 6 swinging bucket rotor |
| Mini Centrifuge | |||
| 20 °C incubator | |||
| 4 °C refrigerator | |||
| -20 °C freezer | |||
| Observer Z1 microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens | Zeiss | ||
| Ultraview Vox spinning disc confocal system | PerkinElmer | Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy |
References
- Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).
- Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
- Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
- Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
- Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
- ThermoFisher. . Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).
- Pazdernik, N., Schedl, T. . Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
- Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
- Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
- Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).
- Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
- Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), 2258-2270 (1999).
- Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
- Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
- Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
- Vos, K. . De Cell Counter Plugin. , (2015).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rasband, W. . ImageJ. , (2016).
- Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), 671-680 (2010).
- Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
- Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
- Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).
- . . Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).
- Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).
