Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

In der tierischen Entwicklung müssen Hunderte, Tausende, Millionen, Milliarden oder gar Billionen von Zellteilungen erwachsenen Organismus bilden. Zellzyklus, die Menge der zelluläre Ereignisse bestehend aus G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap), und M (Mitose) definieren die Reihe von Veranstaltungen, die Ausführung jeder Zellteilung. Der Zellzyklus ist dynamisch und in Echtzeit, was technisch schwierig sein kann, am besten geschätzt. In diesem Protokoll vorgestellten Techniken erlauben es, die Messungen der Phasen und Timing des Zellzyklus von Standbildern zu machen.

Etikettierung mit Nukleosid-Analoga z. B. 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2′-Deoxyuridine (BrdU) ist der Goldstandard, S-Phase in den Studien des Zellzyklus Dynamik in den Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) Erwachsenen zu identifizieren zwittrige Keimbahn^1,2,3,4,5. EdU und BrdU kann in nahezu jedem genetischen Hintergrund verwendet werden, da sie nicht auf irgendwelche genetischen Konstrukt angewiesen sind. Visualisierung von BrdU erfordert harte chemische Behandlung aussetzen Antigen für Anti-BrdU Antikörper Färbung, oft mit der Beurteilung der anderen zellulären Marker visualisiert, indem gemeinsam mit zusätzlichen Antikörper Färbung nicht kompatibel ist. Im Gegensatz dazu visualisieren EdU erfolgt durch Click-Chemie unter milden Bedingungen und ist somit kompatibel mit Antikörper Co Färbung^6,7.

Die Besonderheit des Labels ist klar, da Kerne nur die Thymidin (5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine) Entsprechungen in DNA während der S-Phase zu integrieren. Visualisierung erfolgt im festen Gewebe. Das EdU Etikett unsichtbar selbst bis eine azid-haltigen Farbstoff oder Fluorophor reagiert kovalent mit Alkinen in EdU durch Kupfer-katalysierte Klick-Chemie-⁸. EdU Kennzeichnung kann sofortige Auskunft auf die Kerne in S-Phase, einen kurzen Impuls sind der Beschriftung verwenden. EdU kann auch dynamische Informationen bereitstellen, mit Puls-Jagd oder fortlaufende Kennzeichnung; zum Beispiel in einem Puls-Chase-Experiment, das Label wird bei jeder Zellteilung verdünnt oder als nondividing Zellen Fortschritt durch Entwicklung weitergegeben.

C. Elegans Hermaphrodite Keimbahn ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus. Die Erwachsenen Keimbahn ist eine polarisierte Montagelinie mit Stammzellen gefunden am distalen Ende gefolgt von ein- und Progression durch meiotische Prophase, koordiniert mit den Phasen der Gametogenese mehr proximal (Abbildung 1). Am proximalen Ende Eizellen Reifen, sind Eisprung befruchtet und beginnen Embryogenese in der Gebärmutter^9,10,11. Die Zelle ~ 20 Durchmesser lange Region nahe der distalen Spitze-Zelle, die mitotically Radsport Germline Stem, Vorläuferzellen und meiotischen Zellen der S-Phase aber nicht auf die Zellen in meiotischen Prophase enthält, nennt man den Stammvater Zone^{2,4 , 9 , 12}. die Zellmembranen bieten unvollständige Trennung zwischen den Kernen in den distalen Keimbahn, aber Zone Vorläuferzellen unterziehen mitotische Zelle Radfahren weitgehend selbstständig. Die mediane mitotische Zelle Zyklusdauer der Keimbahn Zone Vorläuferzellen in jungen Erwachsenen Hermaphroditen ist ~6.5 h; G1-Phase ist kurz oder abwesend, und Ruhe ist nicht eingehalten,^1,2,13. Keimbahn Stammzell-Differenzierung erfolgt durch im wesentlichen direkten Differenzierung und somit fehlt Transit-Verstärkung Divisionen⁴. Während der Differenzierung in der Pachytene Phase etwa 4 von 5 Kerne werden keine Eizellen bilden aber stattdessen Apoptose, als Krankenschwester Zellen durch eine Spende den zytoplasmatischen Inhalt in den Entwicklungsländern Eizelle^{12,14 , 15}.

Neben der Kennzeichnung Zellen in der S-Phase mit Nukleosid-Analoga kann man die Zellen in Mitose und Meiose mit Antikörper Färbung identifizieren. Kerne in Mitose sind immunreaktiven zu Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Antikörper (so genannte pH3)^7,16. Kerne in Meiose sind immunreaktiven Anti-ihn-3 Antikörper (ein meiotische Chromosomen Achse Protein)¹⁷. Kerne in der Stammvater Zone können durch das Fehlen von HIM-3, das Vorhandensein von nucleoplasmic REC-8¹⁸oder das Vorhandensein von WAPL-1¹⁹identifiziert werden. WAPL-1 Intensität ist in der somatischen Gonade, hoch in der Stammvater Zone am höchsten und niedrigen während frühen meiotischen Prophases¹⁹. Mehreren Zellzyklus Messung ist möglich mit ein paar Variationen im Protokoll: ich) Kerne in S-Phase zu identifizieren und Messen S-Phase Index; (II) ermitteln Sie Kerne M-Phase und Messen Sie den M-Phase-Index zu; (III) bestimmen Sie, ob Kerne in mitotischen oder meiotische S-Phase wurden; (IV) messen Sie die Dauer der G2; (V) messen Sie die Duartion G2 + M + G1 Phasen; (VI) messen Sie die Geschwindigkeit der meiotischen Eintrag; (VII) die Rate der meiotic Progression zu schätzen.

Man kann mehrere Zellzyklus-Messungen von nur ein paar Arten von nass-Labor Experimente machen. Das Protokoll unten beschreibt eine 30 min Puls Kennzeichnung durch die Fütterung von C. Elegans adulter Hermaphrodites mit EdU Bakterien und Co Kennzeichnung M-Phase Zellen nach Färbung mit Antikörper Anti-pH3 und Vorläuferzellen Zone Zellen durch Färbung mit Anti-WAPL-1 Antikörper beschriftet. Nur Änderungen in der Dauer der EdU feed (Schritt 2.5), Art der Antikörper eingesetzt (Schritt 5) und Analysen (Schritt 8.3) sind für die weiteren Messungen erforderlich.