Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU

En développement animal, centaines, milliers, millions, milliards ou même des trillions de divisions cellulaires sont nécessaires pour former l’organisme adulte. Le cycle cellulaire, composé de l’ensemble des événements cellulaires de G1 (gap), S (synthèse), G2 (gap), et M (mitose) définissent la série d’événements qui sont exécutées à chaque division cellulaire. Le cycle cellulaire est dynamique et mieux appréciée en temps réel, qui peut être techniquement difficile. Les techniques présentées dans le présent protocole permettent d’effectuer les mesures des phases et le calendrier du cycle cellulaire des images fixes.

Marquage avec des analogues de nucléosides comme 5-éthynyl-2′-déoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) est l’étalon-or pour identifier la phase S dans les études de la dynamique du cycle cellulaire chez l’adulte Caenorhabditis elegans (c. elegans) lignée germinale hermaphrodite^1,2,3,4,5. EdU et BrdU peuvent être utilisé dans presque n’importe quel fond génétique, car ils ne reposent pas sur n’importe quelle construction génétique. Visualisation BrdU nécessite un traitement chimique sévère pour exposer l’antigène anticorps anti-BrdU, coloration, qui est souvent incompatible avec l’évaluation d’autres marqueurs cellulaires visualisées par la souillure conjointement avec d’autres anticorps. En revanche, la visualisation EdU s’effectue par chimie de clic dans des conditions douces et est donc compatible avec anticorps co coloration^6,7.

La spécificité de l’étiquette est évidente, puisque les noyaux incorporent seulement les analogues (5-éthynyl-2′-déoxyuridine) de thymidine dans l’ADN au cours de la phase S. Visualisation se déroule dans le tissu fixe. L’étiquette EdU est invisible par lui-même jusqu’à un colorant contenant de l’azide ou fluorophore réagit par liaison covalente avec l’alcyne en EdU par clic catalysé par le cuivre chimie⁸. EdU étiquetage peut fournir des informations immédiates sur lequel les noyaux sont en phase S, à l’aide d’une brève impulsion d’étiquetage. EdU peut également fournir des informations dynamiques, à l’aide de pulse-chase ou marquage continu ; par exemple, dans une expérience de chasse, l’étiquette est dilué à chaque division cellulaire soit propagée aussi ne se divisant pas cellules progrès par le développement.

La lignée germinale hermaphrodite de c. elegans est un système puissant de modèle pour les études de la signalisation des voies, des cellules souches, la méiose et cycle cellulaire. La lignée germinale adulte est une chaîne de montage polarisée avec des cellules souches à l’extrémité distale, suivie de l’entrée et la progression à travers la prophase méiotique, coordonnée avec les stades de la gamétogenèse plus proximale (Figure 1). À l’extrémité proximale, ovocytes matures, sont ovulés et fertilisé et commencent l’embryogenèse dans l’utérus^9,10,11. La région de long ~ 20 cellules de diamètre près du capteur de l’extrémité distale, qui comprend la tige de la lignée germinale mitotiquement cyclisme, cellules progénitrices et cellules en phase S méiotiques mais pas les cellules en prophase méiotique, s’appelle l’ancêtre zone^{2,4 , 9 , 12}. les membranes des cellules fournissent une séparation incomplète entre les noyaux dans la lignée germinale distale, mais les cellules progénitrices de la zone subissent une mitose cellule cyclisme en grande partie indépendamment. La durée médiane cycle cellulaire mitotique des cellules de la zone germinale progénitrices en jeunes adultes hermaphrodites est ~6.5 h ; La phase G1 est brève ou absent, et le repos n’est pas observé de^1,2,13. Différenciation des cellules souches germinales se fait par différenciation essentiellement directe et donc n’a pas de titres de transport en commun-amplification⁴. Au cours de la différenciation dans le stade pachytène, environ 4 des 5 noyaux ne feront pas d’ovocytes mais plutôt apoptose, agissant comme cellules nourricières en faisant don de leur contenu cytoplasmique à l’ovocyte en développement^{12,14 , 15}.

En plus de l’étiquetage des cellules en phase S avec les analogues nucléosidiques, on peut identifier les cellules en mitose et méiose utilisant des anticorps. Lors de la mitose, les noyaux sont immunoréactives à anti-phospho-histone H3 (Ser10) anticorps (appelé pH3)^7,16. Lors de la méiose, les noyaux sont immunoréactives à anticorps anti-lui-3 (une protéine d’axe méiotique)¹⁷. Noyaux dans la zone de souches peuvent être identifiées par l’absence de HIM-3, la présence de nucléoplasmique REC-8¹⁸ou la présence de WAPL-1¹⁹. WAPL-1 intensité est plus élevée dans la gonade somatique, élevée dans la zone de l’ancêtre et faible pendant début prophases méiotiques¹⁹. Plusieurs mesures de cycle cellulaire sont possibles avec quelques variations dans le protocole : J’ai) identifier les noyaux en phase S et mesurer l’indice de la phase S ; II) identifier les noyaux en phase M et mesurer l’indice de la phase M ; III) déterminer si les noyaux étaient en phase S mitotique ou méiotique ; IV) mesure la durée du G2 ; V) mesure la duartion des phases G2 + M + G1 ; VI) mesure le taux d’entrée méiotique ; VII) estimer le taux de progression de la méiose.

On peut faire plusieurs mesures cycle cellulaire de seulement quelques types d’expériences de wet-lab. Le protocole ci-dessous décrit un étiquetage d’impulsion de 30 min en se nourrissant de c. elegans adultes hermaphrodites avec EdU étiqueté les bactéries et les cellules de phase M co marquage par coloration avec progénitrices et anticorps anti-pH3 cellules de la zone de coloration avec l’anticorps anti-WAPL-1. Seuls les changements dans la durée de l’Education se nourrissent (étape 2.5), type d’anticorps utilisé (étape 5), et analyses (étape 8.3) sont nécessaires pour les mesures supplémentaires.