Cell Cycle analyse in de C. elegans Germline met de Thymidine analoge EdU

In dierlijke ontwikkeling, honderden, duizenden, miljoenen, miljarden of zelfs miljarden celdelingen dienen te vormen van het volwassen organisme. De celcyclus, het aantal cellulaire gebeurtenissen samengesteld uit G1 (gap), S (synthese), G2 (gap), en M (mitose) definiëren de reeks van gebeurtenissen die zijn uitgevoerd elke celdeling. De celcyclus is dynamisch en best gewaardeerde in reële tijd, die kan technisch moeilijk. De technieken die in dit protocol gepresenteerd toelaten dat een om de metingen van de fasen en timing van de celcyclus van stilstaande beelden te maken.

Labelen met nucleoside analogen zoals 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) of 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) is de gouden standaard om te identificeren van de S-fase in de studies van de celcyclus dynamiek in de Caenorhabditis elegans (C. elegans) volwassene hermafrodiete germline^1,2,3,4,5. Zowel de EdU als BrdU kan worden gebruikt in bijna elke genetische achtergrond, als zij niet op een genetische construct baseren zich. Visualiseren van BrdU vereist agressieve chemische behandeling om het antigeen voor anti-BrdU antilichamen tegen vlekken, die vaak onverenigbaar is met de beoordeling van andere cellulaire markers gevisualiseerd door mede kleuring met extra antilichamen bloot te stellen. Daarentegen visualiseren EdU treedt op door klik chemie milde omstandigheden en is dus compatibel met antilichaam mede kleuring^6,7.

De specificiteit van het label is duidelijk, omdat kernen alleen de (5-ethynyl-2′-deoxyuridine)-analogen van thymidine in DNA tijdens de S-fase integreren. Visualisatie vindt plaats in vaste weefsel. De EdU-label is onzichtbaar vanzelf tot een azide-bevattende kleurstof of fluorophore reageert covalent met de alkyn in EdU door koper-gekatalyseerde Klik scheikunde⁸. EdU labeling bieden onmiddellijk informatie over welke kernen in de S-fase, met behulp van een korte puls van labeling. EdU kan ook dynamische informatie bieden, met behulp van puls-jacht of continu etikettering; bijvoorbeeld, in een puls-chase experiment, het etiket bij elke celdeling wordt verdund of doorgegeven als nondividing cellen vooruitgang door middel van ontwikkeling.

De C. elegans hermafrodiete germline is een krachtig modelsysteem voor de studies van signalering van trajecten, stamcellen, meiose en celcyclus. De volwassen kiemcellen is een gepolariseerde assemblagelijn met stamcellen gevonden op de distale einde gevolgd door ingang en progressie via Meiotische profase, gecoördineerd met de stadia van de geslachtscel meer proximally (Figuur 1). Proximale eind, eicellen rijpen, zijn algemeen en bevrucht en beginnen embryogenese in de baarmoeder^9,10,11. De cel-diameter van ~ 20 lange regio in de buurt van de distale tip-cel, waaronder de mitotically fietsen germline stengel, voorlopercellen en Meiotische cellen in de S-fase maar niet op de cellen in Meiotische profase, heet de voorlopercellen zone^{2,4 , 9 , 12}. de celmembranen bieden onvolledig scheiding tussen de kernen in de distale germline, maar de zone voorlopercellen ondergaan mitotische cel grotendeels zelfstandig fietsen. De duur van de mediane mitotische celcyclus germline van voorlopercellen van zone jonge volwassen hermafrodieten is ~6.5 h; G1-fase is kort of afwezig is, en onbeweeglijkheid^1,2,13niet wordt nageleefd. Germline stamcel differentiatie vindt plaats via in wezen directe differentiatie en dus mist transit-sturen divisies⁴. Tijdens de differentiatie in de pachytene fase, ongeveer 4 van de 5 kernen eicellen niet zullen vormen, maar in plaats daarvan ondergaan apoptosis, fungeert als verpleegkundige cellen door het doneren van hun cytoplasmatische inhoud aan de ontwikkelende oöcyt^{12,14 , 15}.

Naast labeling cellen in de S-fase met nucleoside analogen, men kan het identificeren van de cellen in de mitose en meiose met behulp van antilichaam kleuring. Kernen in de mitose zijn immunoreactive aan anti-phospho-Histon H3 (Ser10) antilichaam (genaamd pH3)^7,16. Kernen in meiose zijn immunoreactive naar anti-hem-3 antilichaam (een Meiotische chromosoom as eiwit)¹⁷. Kernen in de voorlopercellen zone kunnen worden geïdentificeerd door het ontbreken van HIM-3, de aanwezigheid van het nucleoplasmic van REC-8¹⁸of de aanwezigheid van WAPL-1-¹⁹. WAPL-1 intensiteit is het hoogst in de somatische gonaden, hoog in de zone van voorlopercellen, en lage tijdens de vroege Meiotische prophases¹⁹. Verschillende metingen van de celcyclus zijn mogelijk met een paar variaties in het protocol: ik) kernen in de S-fase identificeren en meten van de S-fase index; II) identificeren kernen in M-fase en meten van de M-fase-index; III) bepalen of kernen in mitotische of Meiotische S-fase werden; IV) de duur van de maatregel van G2; V) meten de duartion van G2 + M + G1 fasen; VI) maatregel het tarief van Meiotische binnenkomst; VII) schatting van de mate van Meiotische progressie.

Men kan meerdere metingen van de celcyclus van slechts een paar soorten natte-lab experimenten maken. Het onderstaande protocol beschrijft een 30 min pulse labelen door C. elegans volwassen hermafrodieten vervoederen EdU label bacteriën en co labeling cellen van de M-fase door kleuring met anti-pH3 antilichaam en voorlopercellen zone cellen door kleuring met anti-WAPL-1 antilichaam. Alleen de wijzigingen in de duur van de EdU feed (stap 2.5), soort antilichamen (stap 5), en analyses (stap 8.3) zijn vereist voor de extra metingen.