"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

1. assemblage- en evenwichtsinstelling van platen Zorg ervoor dat zowel de compressor en de leegte pomp die is gekoppeld aan het LiverChip platform zijn ingeschakeld. De vergadering en de evenwichtsinstelling van de platen in een klasse II kabinet uitvoeren. Aseptisch de microfluidic platen te monteren door het plaatsen van een steriele membraan tussen de plaat-base en de goed met bovenplaat (Figuur 1a) toe te voegen. Zorg ervoor dat het steriele membraan soepel op de twee pinnen van de grondplaat, sinds ongelijke membraan plaatsing compromissen de circulatie van microfluidic berust. Voeg een steriele plaat deksel en draai de schroeven aan de voet van de plaat met behulp van een geautomatiseerde precisie koppel aan 33 lb met behulp van een spiraal aanscherping van de reeks. Zorg ervoor dat alle schroeven aan 35 lb met behulp van een handmatige koppel zijn aangescherpt. Tijdens deze stap, waarborgen de schroeven zijn symmetrisch aangescherpt (Figuur 1a). Prewarm hepatocyte seeding middellange met Williams E medium, primaire hepatocyte ontdooien en supplementen, 5% foetale runderserum (FBS) en 1 µM dexamethason tot 37 ° C vóór priming plating. Prime de volledig geassembleerde plaat door binnen het wassen dock plaatsen en het toevoegen van 400 µL van hepatocyte zaaien middellange tot het reservoir kant van elk putje. Zorg ervoor dat de plaat springt het wassen dock volledig. Initiëren stroming in de opwaartse richting van 3,5 min 1 µL/s. De succesvolle functie van het microfluidic verkeer kan worden nagegaan door de rode lampjes aan de zijkant van de plaat (Figuur 1a). Zodra het medium wordt gepompt naar de cel groei kant van de plaat, zorgen voor de juiste montage van de stroom kanaal, voeg een extra 1.2 mL hepatocyte zaaien medium. Zorgvuldig Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 16 h (Figuur 1 c). Overdracht van de plaat aan het wassen-dock en elimineren van bubbels in de put door pipetteren zachtjes op en neer. Voeg een steriele, ronde filtreerpapier, gevolgd door een cel bijlage steiger en een Borgring, aan elk putje met steriel pincet. Elk putje met een steriele zuiger ingedrukt te vergrendelen van de behoudende ringen en steigers vastklikt (Figuur 1b). Gecombineerd alle middellange en Voeg 400 µL voorverwarmde hepatocyte seeding medium zachtjes over de steiger en initiëren van stroom in de neerwaartse richting voor 3,5 min 1 µL/s. Aspirate alle medium uit het reservoir kant van de plaat gepompt. Deze stap is noodzakelijk ter vervanging van het medium opgenomen in het kanaal van de stroom. Voeg 1,4 mL hepatocyte zaaien medium aan elk putje voordat hij terugkeerde van de plaat naar het dock te voltooien van het totale volume per putje. Het volume per putje is nu 1.6 mL (1,4 mL in de put en 0,2 mL in het stroom-kanaal). 2. ontdooien en zaaien van hepatocyten voor monoculturen Prewarm hepatocyte ontdooien medium en hepatocyte seeding middellange tot 37 ° C vóór het ontdooien van een flacon van PHH volgens de instructies van de leverancier. Gebruik een centrifuge bij kamertemperatuur tijdens deze stap te voorkomen abrupte temperatuurveranderingen. Het uitvoeren van het ontdooien en verzorgt de seeding van de hepatocyten in een klasse II kabinet. Resuspendeer de cellen in 1 mL hepatocyte seeding voedingsbodem en met behulp van trypan blauwe cellen tellen. Ervoor zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90%. Houd de cellen op ijs totdat ze worden toegevoegd aan de putten. Breng de geëquilibreerd en volledig geassembleerd plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. 600.000 hepatocyten toevoegen aan elk putje in een 500 µL volume hepatocyte seeding medium. Initiëren van stroming in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s en zodat het totale volume in de put tot 1,6 mL door 900 µL van hepatocyte zaaien medium toe te voegen. Breng de plaat naar het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door een omkering van de stroom naar de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u initiëren. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van hepatocyte onderhoud medium (Williams E medium aangevuld met hepatocyte onderhoud supplementen en 100 nM dexamethason) voor elke stroomsnelheid van het goed en starten in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 3,5 min. Gecombineerd alle medium uit het reservoir en voeg 1,4 mL van hepatocyte onderhoud medium (Figuur 1 d). Vervang het medium met hepatocyte onderhoud medium elke 48 uur. Uitvoeren om ervoor te zorgen dat alle medium in de put wordt vervangen, een wassen stap vóór de toevoeging van verse hepatocyte onderhoud medium. Voor het wassen stap, overdracht van de plaat aan het wassen dock gecombineerd alle medium uit de putten en Voeg 400 µL van onderhoud medium. Initiëren stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten. Voeg 1,4 mL van hepatocyte onderhoud medium en, binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2, breng de plaat in het dockingstation en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1f).Opmerking: Voor hepatocyte monoculturen gebruikt als besturingselementen voor cocultures, met het oog op een gecontroleerde omstandigheden, wordt een tweede soort onderhoud medium gebruikt, die is specifiek voor gebruik in de cocultures met primaire menselijke cellen van de Kupffer. 48 uur na het vervangen van de hepatocyte zaaien medium met hepatocyte onderhoud medium (dag 3 na zaaien), het regelmatige hepatocyte onderhoud medium zal worden vervangen met coculture onderhoud medium II, met name in monoculturen van PHH wanneer het vergelijken bij cocultures van zowel PHH en Kupffer cellen, als de middellange onderdelen enigszins verschillen. 3. ontdooien en zaaien van Kupffer cellen en hepatocyten voor co culturen Met het oog op een nauwkeurige vergelijking van resultaten, vergelijken altijd PHH/Kupffer cel cocultures aan PHH monoculturen Cocultures PHH en Kupffer cellen, ontdooien één flacon van Kupffer cellen in geavanceerde Dulbecco van Eagle’s medium (AdDMEM) zonder dexamethason gewijzigd maar aangevuld met primaire hepatocyte ontdooien en beplating supplementen (coculture zaaien medium) volgens de leveranciersverklaring instructies. Het ontdooien en het zaaien van de cellen van de Kupffer en de hepatocyten in een klasse II kabinet uitvoeren. Resuspendeer de cellen in 1 mL coculture zaaien medium en met behulp van trypan blauwe cellen tellen. Ervoor zorgen dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90%. Houden van de cellen op het ijs voorafgaand aan deze toe te voegen aan de putjes om te voorkomen dat cel adhesie. Volg de instructies in stappen 2.1-2.3 voor het ontdooien van primaire menselijke hepatocyten. Breng de geëquilibreerd en volledig geassembleerd plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. 60.000 Kupffer cellen en/of 600.000 hepatocyten toevoegen aan elk putje in een totaal volume van 250 µL van coculture zaaien medium. Initiëren van stroming in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s en voeg 900 µL van coculture zaaien medium aan elk putje. Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door de omkering van de stroom naar de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u initiëren. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium I (AdDMEM zonder dexamethason maar aangevuld met hepatocyte onderhoud supplementen) bij elke stroomsnelheid van het goed en starten in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 3,5 min. Alle medium uit het reservoir kant gecombineerd en voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium ik aan elk putje. Breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2 en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 uur. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium II (Williams E medium zonder dexamethason maar aangevuld met 100 nM hydrocortison en hepatocyte onderhoud supplementen) en initiëren van stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Gecombineerd alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten. Voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium II en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Stroom in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1e) starten. Vervang het medium elke 48 h met coculture onderhoud medium II. Uitvoeren om ervoor te zorgen dat alle medium in de put wordt vervangen, een wassen stap vóór de toevoeging van verse medium. Om te wassen, overdracht van de plaat aan het wassen dock gecombineerd alle medium uit de putten en Voeg 400 µL van coculture onderhoud medium II. Initiëren stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle medium verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten. Voeg 1,4 mL van coculture onderhoud medium II en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2en stroom in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 h (Figuur 1f) starten. 4. productie van een infectueus Hepatitis B-Virus voor infectie Studies Dit gedeelte van het protocol in een beheersingsniveau III lab uitvoeren. Doen de zaaien, middellange wijzigingen middellange collectie en virus concentratie in een klasse II kabinet. Cultuur van HBV-producerende cellen (bijv. HepDE19, HepAD38) in collageen beklede T1000 5-laags kolven in 120 mL volledige DMEM/F12 (10% FBS, penicilline/steptomycin, niet-essentiële aminozuren, 500 μg/mL G418 en 1 μg/mL tetracycline) totdat ze 90% confluentie bereiken. Te wijzigen in het medium inductie normaal (volledige DMEM zonder tetracycline) om de productie van HBV. De volledige Mediuminhoud elke 48 uur voor 12 dagen na intrekking van tetracycline verzamelen en op te slaan bij 4 ° C. Het verzamelde medium wordt gefiltreerd door een 0,45 µm fles top filter. Incubeer bij 4 ° C voor 16 h. Centrifuge bij 10.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C voor het verzamelen van het virus van PEG-neergeslagen en resuspendeer, steriele PEG 8000 in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toevoegen aan de verzamelde middellange tot een eindconcentratie van 4% w/w en meng door het omkeren van de 8 x-10 x de pellet in PBS met 10% FBS. Combineer het virus PEG-neergeslagen uit alle oogsten tijdstippen en laag het bovenop een 20% sacharose kussen. Centrifugeer bij 140.000 x g gedurende 16 uur bij 4 ° C met een SW28 rotor. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in PBS aangevuld met 10% FBS, en aliquot en opslaan bij-80 ° C. Bepaal de HBV DNA exemplaaraantal aanwezig in het supernatant door HBV DNA qPCR (stap 6). 5. infectie van 3D culturen met HBV Infecties in een klasse II kabinet binnen een beheersingsniveau III lab uitvoeren. 3 dagen na het zaaien de monoculturen of cocultures, het vereiste aantal HBV-bevattende aliquots bij kamertemperatuur ontdooien en Verdun de dosis vereist virus in 1.8 mL hepatocyte onderhoud medium of coculture onderhoud medium II per putje, respectievelijk. Deze 1.8-mL verdunde virus is voldoende voor het wassen stap (400 µL) en de vervanging van medium in de put (1,4 mL). De vereiste veelheid van infectie moet echter worden aangepast aan de definitieve cultuur hoeveelheid 1.6 mL voor hun rekening. Breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Voeg 400 µL van HBV-bevattende medium en initiëren van stroming in de neerwaartse richting bij 1 µL/s voor 3,5 min. Aspirate alle middelgrote verschijnen aan de kant van het reservoir van de putten. Voeg 1,4 mL van HBV-bevattende onderhoud medium/coculture “onderhoud” middellange II per goed af en breng de plaat in het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2. Stroom in de neerwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 8u, gevolgd door een omkering van de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s te initiëren. 24u na de toevoeging van HBV, breng de plaat aan het wassen-dock en gecombineerd alle medium uit de putten. Wassen elk goed in de plaat 3 x met de overeenkomstige medium, afhankelijk van het type van de cultuur zoals beschreven in stappen 2.12-2.14, te elimineren overgebleven virus uit de put. In tegenstelling tot stappen 2.12-2.14, toevoegen 1.6 mL medium in elk goed aan account voor het extra volume te bemonsteren om uit te sluiten van entmateriaal overdracht (Figuur 1 g). Na deze stappen wassen 200 µL van medium van elk putje te bevestigen de volledige verwijdering van de HBV entmateriaal door kwantificering van extracellulaire HBV DNA te verzamelen. De plaat overbrengen naar het docking station binnen een bevochtigde incubator bij 37 ° C en met 5% CO2, en initiëren van stroming in de opwaartse richting op een debiet van 1 µL/s voor 48 uur. 48 uur later verzamelen het volledige goed volume voor downstream-analyse, gevolgd door drie wast met hepatocyte onderhoud medium zoals beschreven in stappen 2.12-2.14. Vervang het medium en wassen van elke goed 3 x elke 48 h tot experimentele beëindiging. 6. kwantificering van extracellulaire HBV-DNA Totale DNA van het supernatant van cultuur volgens de instructies van de fabrikant met de toevoeging van 1 microgram van vervoerder RNA in een beheersingsniveau III lab om ervoor te zorgen de inactivering van het virus in de monsters voorafgaande aan ze te verplaatsen naar een ander gebied te isoleren. Voorbereiding van een master mix met kwantitatieve PCR master mix, 600 nM voorwaartse primer, 600 nM omgekeerde primer, en 300 nM van sonde. Voeg 7 µL van de master mix in elk putje van de plaat van een 384-well. Voeg 5 µL van DNA-monsters in tweevoud, een neen-template besturingselement en duplicaten van serieel verdunde HBV genoom-bevattende plasmide gebaseerde standaard (bijvoorbeeld pCMV-HBV) variërend van 109 exemplaren per reactie op 102 exemplaren per reactie aan elk putje van de qPCR plaat. Plaatst u een zelfklevende dekking boven de plaat en ervoor te zorgen dat elk goed is afgedicht correct. De plaat voor 1 min bij 300 x gcentrifugeren. Start de qPCR uitvoeren volgens de instructies van de fabrikant. De voorwaarden van de cyclus voor PCR in real time zijn 95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut. Het aantal HBV-DNA-kopieën binnen de onbekende monsters volgens de standaard curve te kwantificeren. 7. kwantificering van intracellulaire HBV Pregenomic (pg) RNA Isoleren totaal RNA van de steigers volgens de instructies van de fabrikant. Met het oog op een volledige cellysis, vortex, elke steigerwerk 3 x voor 30 s gevolgd door centrifugatie bij 300 x g gedurende 1 min tussen elke vortexing. Voer de lysis van de cel in het beheersingsniveau III lab om ervoor te zorgen de inactivering van het virus in de monsters voorafgaande aan ze te verplaatsen naar een ander gebied. Transcribe cDNA van de geïsoleerde RNA volgens de instructies van de fabrikant. De voorwaarden van de cyclus voor de retrotranscription zijn 25 ° C gedurende 10 minuten, 37 ° C gedurende 120 minuten, en 85 ° C gedurende 5 minuten. Houd de cDNA monsters bij 4 ° C gedurende korte of bij-20 ° C voor langdurige opslag. Master mixen voorbereiden op pgRNA en RPS11 met kwantitatieve PCR master mix en voorwaartse en omgekeerde inleidingen voor pgRNA en RPS11 (gebruikt als schoonmaak gene) op een eindconcentratie van 0,2 µM. Voeg 7,5 µL van de master mix en 2.5 µL van cDNA per putje op een 384-well-plaat. Meten van RPS11 en pgRNA van elk monster in tweevoud en een neen-template besturingselement goed voor beide genen bevatten. Plaatst u een zelfklevende dekking boven de plaat en ervoor te zorgen dat elk goed is verzegeld geheel. De plaat voor 1 min bij 300 x gcentrifugeren. Plaats de plaat in de qPCR-cycler en start van de qPCR uitgevoerd met behulp van het standaard kwantitatieve PCR protocol volgens de instructies van de fabrikant. De voorwaarden van de cyclus voor PCR in real time zijn 50 ° C voor 2 min, 95 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 minuut. Bereken de uitdrukking van pgRNA ten opzichte van RPS11. 8. immunofluorescentie kleuring van virusantigeen Verwijder de borgring uit de put en het schavot met pincet in een klasse II kabinet in de insluiting niveau III lab. Het herstellen van de cel-bevattende steigers met 4% paraformaldehyde in 1 mL PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het beheersingsniveau III lab. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd in een ander gebied. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS. Permeabilize van de cellen met behulp van 0,1% Triton-X 100 in 1 mL PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS. Blok niet-specifieke binding door incubatie van de steigers met 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Wassen van de steigers 3 x met 1 mL PBS. Uitvoeren primair antilichaam kleuring met behulp van konijn anti-hepatitis B virus core antigeen bij een verdunning 1:200 in 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Wassen van de steigers 1 x met 0,1% Tween in 1 mL PBS (PBS-Tween) en 3 x met 1 mL PBS. Uitvoeren van secundair antilichaam kleuring met geit anti-konijn IgG (H + L) kruis-geadsorbeerde Alexa Fluor 594-geconjugeerde secundair antilichaam bij een verdunning 1:2,000 in 1% BSA in 1 mL PBS gedurende 16 uur bij 4 ° C. Wassen van de steigers 1 x met 1 mL 0,1% PBS-Tween en 3 x met 1 mL PBS. Counterstain de steigers DAPI met 1 mL PBS met een concentratie van 2 µg/mL gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Wassen van de steigers 1 x met 1 mL 0,1% PBS-Tween en 3 x met 1 mL PBS. De steigers overbrengen in een microscoopglaasje en dit koppelen voor imaging. Het imago van de steigers met behulp van een fluorescentie Microscoop. 9. menselijke albumine ELISA Dit gedeelte van het protocol in een klasse II kabinet toegewezen in het beheersingsniveau III lab als werken met besmettelijke materiaal uit te voeren. Evalueren om te beoordelen van de levensvatbaarheid en metabole functionaliteit van PHH, menselijke albumine productie door ELISA. Jas 96-wells-platen met 50 µL per putje van geit anti-menselijke antilichamen verdund 1:800 in de coating buffer (100 mM bicarbonaat/carbonaat, pH 9,6). Dekking van de platen en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C of ‘s nachts bij 4 ° C. Het antilichaam van de coating van de plaat gecombineerd en wassen het 4 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween. Voeg 200 µL van blokkeerbuffer (1% BSA in PBS), betrekking hebben op de platen, en hen Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of bewaar ze bij 4 ° C voor 3 maanden. Voor langdurige opslag, aan de buffer met blokkerend met toevoegen van 0,05% natriumazide. De buffer met blokkerend gecombineerd en 1 x met 200 µL van 0,05% wassen PBS-Tween. Voeg 50 µL van eerder verdunde monsters per putje (1:100). De monster verdunningsmiddel bevat 1% BSA in 0.05% PBS-Tween. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of ‘s nachts bij 4 ° C.Opmerking: Incubeer de normen op hetzelfde moment als de monsters. Een concentratiebereik van 500-0.488 ng/mL (1:2 seriële verdunningen) wordt aanbevolen. Voer alle seriële verdunningen van menselijke albumine in monster verdunningsmiddel. De monsters van de plaat gecombineerd en wassen het 4 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween. Voeg toe 50 µL van HRP-geconjugeerde geit anti-menselijke albumine antilichaam verdund eerder 1:10,000 in monster verdunningsmiddel. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C of ‘s nachts bij 4 ° C. Het antilichaam van de plaat gecombineerd en wassen het 6 x met 200 µL van 0,05% PBS-Tween. Voeg 100 µL van TMB reagens en, zodra de hoogste normen zijn volledig ontwikkeld, voeg 100 µL 1 M H2dus4 om te stoppen met de colorimetrische reactie. Lees de absorptie bij 450 nm op een 96-Wells-afleesapparaat voor analyse. 10. Interleukine (IL) 6 en Tumor necrose factoren (TNF) α productie in 3D co culturen Dit gedeelte van het protocol in een klasse II kabinet toegewezen in het beheersingsniveau III lab als werken met besmettelijke materiaal uit te voeren. Kwantificeren van de productie van het IL6 en TNFα om de functionaliteit en levensvatbaarheid van de primaire Kupffer cellen te evalueren. Om de productie van deze cytokines door Kupffer cellen, cocultures met 1 µg/mL lipopolysaccharide (LPS) 9 d na zaaien in het coculture onderhoud medium II voor 48 uur te behandelen. Op dag 11 na zaaien, oogsten van het medium van elk putje en opslaan bij-80 ° C. Meet de IL6 en TNFα concentratie in het kweekmedium door een passende bepaling en volgens de instructies van de fabrikant.