Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

Células de apresentação de antígeno artificial (aAPC) têm mostrado promessa como agentes imunomoduladores porque elas podem gerar uma resposta robusta pilha de T antígeno-específicas. Essenciais para essas plataformas são sua capacidade de apresentar eficientemente cruciais sinais para a ativação de células T. AAPC acelular são uma alternativa atraente para aAPC baseados em células, porque eles são mais fácil e menos dispendiosa fabricar, enfrentam poucos desafios durante o scale-up e Tradução e atenuar os riscos associados com terapias baseadas em células. AAPC acelular também permitem um alto grau de controle sobre parâmetros de apresentação do sinal e propriedades físicas da superfície que irá interagir com T células¹.

aAPC deve recapitular um mínimo de dois sinais essenciais para a ativação de células T. Sinal 1 prevê o reconhecimento do antígeno e ocorre quando o receptor de células T (TCR) reconhece e se envolve com um MHC-classe I ou II, tendo seu antígeno cognato, culminando na sinalização através do TCR complexo. Para contornar a exigência de especificidade do antígeno, aAPC sistemas frequentemente suportar um agonístico anticorpo monoclonal contra o receptor CD3, que nonspecifically estimula o complexo TCR. Formas recombinantes do MHC, particularmente oriundas de MHC, também utilizámos na superfície da aAPC para fornecer o antígeno especificidade^2,3. Sinal 2 é um sinal de co-estimulação que direciona a atividade das células T. Para fornecer o costimulation necessária para a ativação de células T, o receptor CD28 geralmente é estimulado com um anticorpo agonístico apresentado na superfície aAPC, apesar de outros receptores co-estimulação como 4-1BB foram alvejados com sucesso⁴. Proteínas de sinal 1 e 2 são normalmente imobilizadas na superfície de partículas rígidas para sintetizar aAPC. Historicamente, aAPC têm sido fabricados a partir de uma variedade de materiais, incluindo poliestireno^4,5 e ferro dextrano⁶. Sistemas mais novos utilizam polímeros biodegradáveis como poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) para gerar aAPC que pode ser facilmente acoplado para sinalizar proteínas, é adequados para a administração direta na vivoe pode facilitar a liberação sustentada de encapsulados de citocinas ou fatores solúveis para aumentar a ativação de célula T^7,8.

Além da presença de proteínas de sinal necessário, engajamento do receptor sobre uma superfície suficientemente grande durante a interação de célula aAPC/T é essencial para a ativação de células T. Assim, os parâmetros físicos da aAPC como tamanho e forma drasticamente alteram sua área de contato disponível e afetam sua capacidade de estimular células T. AAPC micro-empresas foram mostrados para ser mais eficaz em estimular as células T do que suas contrapartes de nanoescala^9,10. No entanto, nano-aAPC pode ter biodistribuição superior e melhor drenagem para os linfonodos que pode melhorar seu desempenho na vivo sobre micro-aAPC¹¹. A forma é outra variável de interesse em sistemas baseados em partículas aAPC. AAPC anisotrópica recentemente foram mostrados para ser mais eficaz do que partículas isotrópicas a estimular as células T, principalmente devido à interação aprimorada com células alvo juntamente com absorção reduzida celular específico. Células ligam preferencialmente ao eixo longo de partículas elipsoidais, e o maior raio de curvatura e superfície mais plana que permitem mais contato entre a aAPC e células T¹². O longo eixo das partículas elipsoidais também desencoraja a fagocitose, resultando em aumento da circulação de tempo em comparação com as partículas esféricas em vivo administração^12,13a seguir. Devido a estas vantagens, partículas elipsoidais mediam a maior expansão do antígeno-específicas T células in vitro e em vivo em comparação com as partículas esféricas, um efeito observado em ambos os micro e nanoscales^{12, 13}. Existem várias estratégias para fabricar partículas anisotrópicas, mas alongamento de película fina é um método simples, amplamente aceitado, usado para gerar uma gama de partículas diversas formas¹⁴. Após a síntese, partículas são lançadas filmes e esticadas em uma ou duas dimensões, a uma temperatura acima da temperatura de transição vítrea do material das partículas. O filme é então dissolvido para recuperar as partículas. Apesar do crescente interesse em partículas anisotrópicas, abordagens atuais para fabricação baseada em partículas aAPC limitam-se principalmente aos sistemas isotrópicos, e métodos de alterar a forma das partículas podem ser difícil de implementar, incompatível com certa síntese aAPC estratégias e falta de precisão e reprodutibilidade¹⁵. Nossa técnica de alongamento de película fina pode ser executada manualmente ou em um modo automatizado para gerar rapidamente partículas anisotrópicas sintetizadas a partir de uma variedade de polímeros biodegradáveis, esticada para uma proporção desejada em uma ou duas dimensões¹⁵.

Baseado no nosso trabalho anterior, desenvolvemos uma abordagem baseada em partículas biodegradável combinada com tecnologia de alongamento de thin-film escalável para gerar rapidamente aAPC com tamanho ajustável e a forma de uma forma padronizada para células T expansão ex vivo ou em vivo. Nossa estratégia de conjugação de proteínas pode ser usada para acoplar qualquer somáticas de interesse aos grupos da carboxila na superfície da partícula em uma densidade desejada, dando a este sistema de aAPC um alto grau de flexibilidade. Descrevemos também métodos para caracterizar o tamanho, morfologia e teor de aAPC de proteínas de superfície e para avaliar sua funcionalidade em vitro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para expandir as células imunes ex vivo ou na vivo para uma variedade de aplicações de imunoterapia.