Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Cellule presentanti l’antigene artificiale (aAPC) hanno indicato la promessa come agenti immunomodulatori perché possono generare una risposta robusta cellula di T antigene-specifiche. Essenziale per queste piattaforme sono la loro capacità di presentare in modo efficiente i segnali cruciali per l’attivazione delle cellule T. AAPC acellular sono un’alternativa attraente ai aAPC basati su cellule perché sono più facili e meno costoso da fabbricare, affrontare sfide meno durante scale-up e traduzione e alleviare i rischi connessi con le terapie basate sulle cellule. AAPC acellulare consentono anche di un elevato grado di controllo sui parametri di presentazione di segnale e le proprietà fisiche della superficie che si interfaccia con le cellule di T¹.

aAPC deve ricapitolare un minimo di due segnali essenziali per l’attivazione delle cellule T. Segnale 1 fornisce il riconoscimento dell’antigene e si verifica quando il recettore delle cellule T (TCR) riconosce e si impegna con un MHC di classe I o II cuscinetto suo antigene cognata, che culmina nella segnalazione attraverso il complesso TCR. Per ignorare il requisito di specificità dell’antigene, aAPC sistemi spesso sopportano un agonistica dell’anticorpo monoclonale contro il recettore CD3, che non specifico stimola il complesso TCR. Forme ricombinanti di MHC, particolarmente dei multimeri MHC, sono state utilizzate anche sulla superficie della aAPC per fornire la specificità dell’antigene^2,3. 2 è un segnale di costimolazione che indirizza l’attività delle cellule T. Per fornire la costimolazione necessari per l’attivazione delle cellule T, il recettore CD28 generalmente viene stimolato con un anticorpo agonista presentato sulla superficie aAPC, sebbene altri recettori costimolazione quali 4-1BB siano stati correttamente mirate⁴. Proteine di segnale 1 e 2 sono in genere immobilizzati sulla superficie delle particelle rigide di sintetizzare aAPC. Storicamente, aAPC sono stati fabbricati da una varietà di materiali, tra cui polistirolo^4,5 e ferro destrano⁶. Sistemi più recenti utilizzano polimeri biodegradabili come poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) per generare aAPC che può essere facilmente accoppiato per proteine di segnale, sono adatti per amministrazione diretta in vivoe può facilitare il rilascio prolungato di incapsulato citochine o fattori solubili per aumentare l’attivazione delle cellule T^7,8.

Oltre alla presenza di proteine di segnale necessario, impegno del ricevitore su una superficie sufficientemente grande durante l’interazione aAPC/T è essenziale per l’attivazione delle cellule T. Così, parametri fisici di aAPC quali dimensioni e forma drasticamente alterano la loro area di contatto disponibile e influenzano la loro capacità di stimolare le cellule T. AAPC micron imprese hanno dimostrato di essere più efficace a stimolando le cellule di T di loro su scala nanometrica controparti^9,10. Tuttavia, nano-aAPC possono avere biodistribuzione superiore e migliore drenaggio ai linfonodi che possono migliorare la loro prestazione in vivo sopra micro-aAPC¹¹. Forma è un’altra variabile di interesse in sistemi basati su particelle aAPC. Anisotropo aAPC hanno recentemente dimostrato di essere più efficace di particelle isotropiche a stimolando le cellule di T, principalmente a causa di interazione avanzata con cellule bersaglio accoppiato con l’assorbimento riduttore delle cellule aspecifiche. Le cellule legano preferenzialmente all’asse lungo del ellissoidale particelle, e il più grande raggio di curvatura e la superficie più piatta consentono più contatto tra la aAPC e la cellula T¹². L’asse lungo di particelle ellissoidali inoltre scoraggia la fagocitosi, con conseguente tempo di circolazione aumentata rispetto a particelle sferiche seguendo in vivo amministrazione^12,13. A causa di questi vantaggi, ellissoidale particelle mediano una maggiore espansione di antigene-specifiche cellule T in vitro e in vivo rispetto a particelle sferiche, un effetto osservato al micro e nanoscales^{12, 13}. Ci sono varie strategie per fabbricare particelle anisotropiche, ma film sottile lo stretching è un metodo ampiamente accettato semplice utilizzato per generare una gamma di particelle diverse forme¹⁴. A seguito di sintesi, particelle sono gettate nel film e allungate in una o due dimensioni ad una temperatura sopra la temperatura di transizione vetrosa del materiale della particella. Il film è poi sciolto per recuperare le particelle. Nonostante la crescente interesse in particelle anisotropiche, approcci attuali per fabbricazione aAPC basati su particelle sono per lo più limitati ai sistemi isotropi e metodi di alterare la forma delle particelle possono essere difficile da implementare, incompatibile con alcune sintesi aAPC strategie e mancanza di precisione e riproducibilità¹⁵. La nostra tecnica di allungamento del film sottile può essere eseguita manualmente o in modo automatico per generare velocemente anisotropiche particelle sintetizzate da una varietà di polimeri biodegradabili, estesa per un rapporto di aspetto desiderato in una o due dimensioni¹⁵.

Basato sul nostro lavoro precedente, abbiamo sviluppato un approccio basato su particelle biodegradabile combinato con scalabile tecnologia a film sottile che si estende per generare velocemente aAPC con forma e dimensioni sintonizzabile ad un modo standardizzato per cellula T espansione ex vivo o in vivo. La nostra strategia di coniugazione di proteina può essere utilizzato per accoppiare qualsiasi proteina di interesse per i gruppi carbossilici sulla superficie della particella ad una densità desiderata, dando questo sistema aAPC un elevato grado di flessibilità. Descriviamo anche metodi per caratterizzare la dimensione, la morfologia e la proteina di superficie contenuta di aAPC e per valutare la loro funzionalità in vitro. Questo protocollo può essere facilmente adattato per espandere le cellule immunitarie ex vivo o in vivo per una varietà di applicazioni di immunoterapia.