水銀、カドミウムの検出のための嫌気性バイオ アッセイ

1. 成長の媒体および露出メディアの準備 250 mL の成長培地を作るため。注:微量元素 #1 ソリューションと微量元素 #2 ソリューションはすでに準備ができて場合、は、1.1.5 のステップに進みます。 1.5 x 10-3 M Na2MoO4, 6.5 × 10-4 M Na2SeO45 x 10-3 M H3ボーの最終的なモルを含むクリーン メスフラスコ (200 mL) の微量元素 #1 ソリューションを準備します。3、および 0.1 M 水酸化ナトリウム。注意: 強アルカリ (NaOH)、腐食性です。確かとき最後のモル濃度が重要微量元素; を表すようにする試薬を計量します。Mo, Se, と b. 滅菌フィールドでフィルターはきれい/滅菌プラスチック/ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) ボトルに 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを使用して滅菌します。 きれいなメスフラスコ 0.01 M MnSO4, 5 × 10-4 M ZnSO4, 3.25 x 10-3 M CoCl2の最終のモルを含む (200 mL) の微量元素 #2 ソリューションを準備 6.25 x 10-3 M NiCl2と 0.1 M H24。注意: 強い酸 (H2SO4) 腐食性します。確かとき最後のモル濃度が重要微量元素; を表すようにする試薬を計量します。Mn, Zn, Co および Ni。 [滅菌] フィールドにフィルターをきれいなガラス瓶に 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを使用して殺菌します。 [滅菌] フィールドにきれい/滅菌ガラス瓶 (250 mL 最小構成);冷凍 (-20 ° C) 因数は、1.25 4 M ナノ3 mL から 200 mL の純水、M9 最小塩 (5 x; 参照テーブルの材料) の 42.5 mL、0.6 M チアミン HCl の 1200 μ L、125 μ L 2 M MgSO4の 2 M グルコース 2.5 mL を追加します。、0.075 M L-ロイシンの 770 μ L/L イソロイシン ・ バリン ソリューション、250 μ L の微量元素 #1、250 μ Lの微量元素 #2、0.01 M EDTA ナトリウムの 250 μ L、塩します。注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルターは、1.1.5 の手順ですべての試薬が準備されるべき。純水は、オートクレーブで滅菌することがあります。 今ステップ 1.1.5 からソリューションを含むガラスのボトルを取る。、緩くキャップは、嫌気性チャンバー空気ロックを循環。 嫌気性チャンバー4ボトルをしっかりと、キャップおよびすべて白い沈殿が消えるまで振るように 0.225 M FeSO4 0.2 M H2の 15 μ L を追加します。注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルター 1.1.7 の手順ですべての試薬が準備されるべき。だから 0.2 M H20.225 M FeSO4を保存4 嫌気性チャンバー。 瓶のキャップを外し、ボトルからキャップを交換、交換する空気のため 1 分待つし、積極的に振る。この手順をもう一度繰り返します。 ボトルにキャップをしっかり、嫌気性チャンバーから取り出して使用するまで冷蔵庫 (4 ° C) でボトルを保管します。 成長媒体は、1.1.5 に 1.1.9 の手順を繰り返すことによって週に一度リメイクする必要があります。 2 x 50 mL 円錐滅菌ポリプロピレン製遠心管で露出媒体の 100 mL を作る: に注: 我々 は、露出中事前に行うことができますしかし、汚染のリスクを最小限に抑えるため暴露試験の日に準備し、冷蔵庫の中に格納されているお勧めします。 嫌気性チャンバー内各 50 mL 遠心管追加嫌気性超純水の 42 mL、1 350 μ M ナトリウム β-Gylcerophosphate 冷凍 (-20 ° C) の因数は、1 M の 2 mL からモップ遊離酸、50 μ L の 1 M (NH4)2、4、2 メートルのブドウ糖の 125 μ L、2.5 M 島の 300 μ L、200 μ L 2.5 M NaOH の。注: 前と 0.22 μ m ポリエーテルサルホン シリンジ フィルターを用いた滅菌フィルター、1.2.1 の手順ですべての試薬が準備されるべき。超純水は、オートクレーブで滅菌熱にあります。2.5 M NaOH と 2.5 M NaOH は、プラスチック/PTFE の瓶に保存する必要があります。記載されているすべての試薬は、嫌気性チャンバーナトリウム β-Gylcerophosphate を除く、(-20 ° C) の冷凍庫に保存することである内保存されなければなりません。一般に、酸素の痕跡が残っていないか確認する嫌気性チャンバーで数日間すべてのプラスチックまたはガラスの部分とコンテナーを残すことをお勧め。 50 mL 遠沈管のキャップ、まあ、横に振る、pH を測定する 10 mL の約数を取り外します。この露出メディアの測定 pH は常に7.00 ± 25 ° C で 0.02を測定しなければなりません。PH はこの範囲内でない場合は、追加した 2.5 M コこれを補正するためのボリュームを調整してください。注: 決して pH プローブと pH を補正するソリューションを滴定しなさい。pH プローブは、露出媒体の汚染の源を表します。PH は 1.2.1 の手順で追加した試薬の製品を必ずします。 5-10 の mM ナノ3ストック溶液を調製し、露出の試金の時に使用する嫌気性チャンバーに残します。注: 5-10 mM ナノ3一次標準を作るのではなくより集中一次ナノ3標準を希釈する方が簡単です。 2. 水銀およびカドミウム標準の準備。 0.2 M H24 8 μ M 第二水銀 (HgII) ソリューションを準備するなど4。 0.2 M H2で millimolar (1 〜 10 mM) HgCl2HgNO3 HgSO4のソリューションを行うことで Hg2 +標準の準備その4。注意: 水銀は猛毒と H24は腐食性。すべての必要な個人用保護具とヒューム フードで動作します。 PTFE の瓶の中 2.1.1 から標準を希釈します。0.2 M H2SO4 4 8 μ M Hg2 +の範囲内の濃度を取得します。注: 使用される酸は、だから分析グレード H2をする必要があります4。 2.1.2 から水銀は、水銀分析装置を使用して検証されるべき (材料の表を参照してください)。注: Hg 濃度を検証するための他の方法を使用可能性があります。 10 μ M の Cd の準備IIソリューション 10 mM H2SO4。 0.1 M H2CdCl2 (粉体の正確な計量範囲 10 〜 50 ミリメートル) の一次標準を準備その4。 希釈に 10 μ M Cd2 +2.2.1 から標準、きれいな酸リンス 20 mL のシリアル希薄のシリーズで PTFE と黒いフェノール スクリュー キャップとホウケイ酸ガラス瓶はゴム製はさみ金を直面しました。4すべての後続のシリアル希釈で 10 mM のまま、H2の濃度を確認します。 3. バイオ センサーの嫌気性暴露試金のための準備 120 μ G/ml アンピシリンを含むホストゲノム スープ プレート-80 ° C cryostock からプレート水銀誘導型バイオ センサー (E. 大腸菌 NEB5α PUC57merR PpFbFp をかくまっている) と恒常発現バイオ センサー (E. 大腸菌 NEB5α PUC19Balch PpFbFp をかくまっている)。これらのバイオ センサー17の生産に関する詳細については我々 の以前に発行された仕事を参照してください。 4:30-17 で 10 mL の LB (+ アンプ) に文化を接種して一晩成長します。注: プレートから始まってそれ暴露試金のための嫌気培養の準備に2 日間になります (すなわち文化は、月曜日の午後 (17-4:30) 開始の準備ができて水曜日正午のまわりで露出の試金)。次の手順は、必要な微生物学的テクニック暴露試験の日に文化を準備する必要が。 平板培養から 1 つの植民地を取るし、ホストゲノム スープ (LB) 21 μ Lアンピシリン ナトリウム塩 (最終濃度は 210 μ G/ml アンプ) 無菌培養管の 100 mg/mL 原液 10 mL を加えます。 インキュベーター/シェーカーに文化を置き、一晩 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。 9-10 AM で次の朝文化を再懸濁します、嫌気 (20% 接種) の日中に成長します。 嫌気性チャンバーにインキュベーター (ステップ 3.2.1) から文化、成長媒体(ステップ 1.1.9) をもたらします。 生殖不能のバルチ管に新鮮な成長中のアンピシリン (210 μ g/mL) 8 mL を追加します。 2 mL の微量遠心チューブに一晩培養と転送の 2 mL を収集します。90 秒間 10,000 の RCF ステップで遠心、上清をダンプし、新鮮な成長培地 2 mLに再懸濁します。8 mL の新鮮な成長中のアンピシリンを含むバルチ管に再懸濁の文化を追加します。 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。嫌気性チャンバーから削除しインキュベーター/シェーカーに配置し、嫌気 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で 3-17 まで成長します。 3 と 17 の間新鮮な成長媒体に 1% の嫌気性菌を実行し、一晩成長します。 培と共に嫌気性チャンバーにバルチ チューブ (ステップ 3.3.4) をもたらします。新鮮な成長媒体(1% 接種) 10 mL に滅菌バルチ チューブ アンプ (210 μ G/ml amp) 文化の100 μ Lを追加します。 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。嫌気性チャンバーから削除、インキュベーター/シェーカーに置き、一晩 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。 9 と 10 の間には、終日 (20% 接種) 嫌気成長する文化を再懸濁します。 嫌気性チャンバーにインキュベーター (ステップ 3.4.1) から文化、成長媒体(ステップ 1.1.9) をもたらします。 滅菌バルチ チューブに培とアンピシリン (210 ug/mL アンプ) の 8 mL を追加します。 2 mL の微量遠心チューブに一晩培養と転送の 2 m を収集します。90 秒間、10,000 × g で遠心、上清をダンプし、新鮮な成長培地 2 mLに再懸濁します。8 mL の新鮮な成長中のアンピシリンを含むバルチ管に再懸濁の文化を追加します。 生殖不能の技術を使用して、慎重にバルチ管のゴム栓を配置します。商工会議所から削除しインキュベーター/シェーカーに配置し、嫌気 220 rpm で振とうしながら 37 ° C で成長します。 (ステップ 3.5.4) 分光光度計を使用するカルチャの増加率を監視、 0.6 の OD600に達するまで。必ず渦文化各 OD を読む前にしてください。注: この手順 3-4 時間、露出媒体(ステップ 1.2) は露出の試金(手順 4.1) と同様、この時間の間に準備されるべき。 文化、 0.6 (± 0.1) の外径600 (3-4 時間の予想成長) に達すると、成長を止めます。 2 x 2 mLの遠心管に嫌気性チャンバー (ステップ 3.6) 管と転送文化をもたらします。90 秒間、10,000 × g で遠心、上清をダンプし、新鮮な露出媒体の 2 x 2 mLで再懸濁します。 3.7.1 洗浄手順を繰り返します。一度成長媒体のすべてのトレースを削除します。 暴露試験(ステップ 4) で使用するバイオ センサーの株式を取得する 7 mL PTFE 標準バイアルに細胞培養 (ステップ 3.7) の両方のマイクロ遠心チューブ用を結合します。注: 必ず徹底的にまだ軽くピペッティング前後使用する前にバイオ センサーの株式をミックスしてください。メソッドは、時間までここで一時停止することがあります。 4. 露出アッセイ 板レイアウトを設計します。注: がすべてピペッティング値計算と株を始める前に準備をしなければ必ず、露出アッセイ。どのように正しく設計する実験とに含めるコントロールのテキストで詳細が。さらに、嫌気性のモニターに示されている嫌気性チャンバー内酸素がある場合、実験を開始しないでください。 96 よくテンプレートに従ってプレート レイアウトをデザインします。3 の技術的な反復実験を実行、これは、32 さまざまな治療法、最適バイアル (図 1を参照) を設定する 4 x 8 のグリッドによって表されます。 図 1: 96 ウェル プレート (左) や、PTFE を含む対応する 4 x 8 のグリッドはプレートに転送する (右) をバイアルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 注: Hg水銀誘導型バイオ センサーの 2 つの治療法と吸収に及ぼす変数の役割のためのテストが各変数に必要な:治療(バイオ センサー + 水銀 + 変数 + 硝酸) とその治療空白(バイオ センサー +変数 + 硝酸).細胞の生理学的変数の役割をテストする場合構成バイオ センサーを使用して 2 つの治療が必要変数ごとに:治療(バイオ センサー + 水銀 + 変数 + 硝酸) と治療の空白(バイオ センサー + 変数 + Hg)。水銀は、カドミウムに置き換えられます可能性があります。Hg や Cd は、較正曲線を実行するときに、変数になります。構成および誘引可能なバイオ センサー (同じプレート レイアウト) で同時に実行する必要はありません。プレート レイアウトと対応する 4 x 8 のグリッド (変数) のマグネシウムの濃度範囲をテストするときのテンプレートの例で提供されます表 1)。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 、 Hg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 0 mM Mg Hg によるバイオ センサー + 硝酸 + 0 mM Mg 0 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー 0 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー b Hg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 0.1 mM Mg Hg によるバイオ センサー + 硝酸 0.1 mM Mg 構成バイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 0.1 mM Mg 0.1 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー c Hg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 1 mM Mg Hg によるバイオ センサー + 硝酸 + 1 mM Mg 1 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー 1 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー d Hg によるバイオ センサー + 水銀 + 硝酸 + 10 mM Mg Hg によるバイオ センサー + 硝酸 + 10 mM Mg 10 mM Mg 硝酸 + Hg 構成バイオ センサー 10 mM Mg + Hg 構成バイオ センサー e 表 1: プレート レイアウトの例 Hg バイオアベイラビリティをテストするバイオ センサーを使用するため (5 nM) マグネシウム (0-10 mM) のグラデーションに アッセイ プレート レイアウトによると 4 x 8 のグリッドを設定します。 7 mL PTFE 標準バイアルをトレイに置きます。注: PTFE バイアルは、酸洗浄/熱使用に先立って滅菌をする必要があります。バイアルは、バイアルの外側を操作することによってのみ処理する必要があります。 各バイアルは、それぞれの治療に対応する露出媒体のボリュームを追加します。注: 2,000 μ L (2 mL) の容量の露出で追加された露出媒体になります:露出媒体μ L = 2,000 μ L-治療 (空白) μ L (など露出媒体 μ l = 2,000-100 μ l (バイオ)-40 μ l (硝酸態窒素)-100 μ l (Hg。)-100 μ L (変数 (例えばMgSO4)) = 1660 μ L)。テスト変数の追加ボリュームが最終巻の 5% (100 μ L) を超えないことを確認します。 各バイアルは、プレート レイアウトに従ってテストする化学変数のソリューションの対応するボリュームを追加します。 1.3 のステップから最終濃度が200 μ M (40-80 μ L)、硝酸を各バイアルに追加します。構成バイオ治療空白のこのステップを除外します。 ステップ 2.1 または 2.2 から追加 Hg (5 nM変数をテストする場合) または Cd (300 nM変数をテストする場合) プレート レイアウトに従ってバイアルに。水銀誘導バイオ治療空白のこのステップを除外します。 Hg を使用している場合は、 4-8 μ Mの在庫を取る、よく振る。100-250 nM Hg ソリューションの作業をするために 7 mL PTFE バイアルの露出媒体のソリューションを希釈します。この実用的なソリューションから必要なバイアルに Hg を追加します。この場合は 0 から 12.5 まで Hg の較正曲線 nM。注: Hg または Cd のバイオアベイラビリティの変数の効果をテストする場合ことを確認 [Hg]、または [Cd] がすべての治療の間で一定です。Hg または Cd に追加すること 1 つのピペット チップを使用して、しかし、バイアルに露出中に触れないでください。 手動で軌道運動で横に振る。注: 実験は、speciate 解決策で Hg または Cd に必要な時間に応じて今停止可能性があります。1 時間以上のままにした場合は、蒸発/汚染を防ぐために PTFE バイアルに PTFE キャップを配置します。 バイオ センサーの株式の均質性を確保するために前後のゆっくりピペットします。バイオ センサーの株式の 100 μ L を各バイアルに追加します。手動で軌道を振る。 以下の条件で読むにウォーム アップをプレート リーダーの準備: 37˚C, 運動軌道振動 2.5 5 分ごとの読み取りと10 時間の間に読み取り、実行し、と蛍光測定温440 の蛍光励起 nmと排出量 500 nm。 96 well プレートの対応する井戸に 4 x 8 のグリッドで各 PTFE バイアルから200 μ Lをピペット (黒、96 ウェル クリア-下制約表面プレート)。各 200 μ L を転送する前に 5 回ピペット前後。注意: ピペット チップを廃棄するのではなく、ピペッティングの進行状況を追跡するため PTFE バイアルにピペット チップをおきます。 96 ウェル プレートをプレート リーダーのトレイに配置し、96 well プレートのふたを閉めてアッセイを開始します。 5. データの定量化 各時点での各治療の蛍光をそれぞれ個々 よくノイズを補正し、空白にする必要があります、治療空白。 それぞれの治療(T) の各時点 (t) の蛍光はポイント 3治療全体の平均し、各ウェルの複製 (r1r3 回目の初期蛍光 (t0) のアカウントに変換しなければなりません). この治療の平均は、平均治療空白(TB) 同じ方法 (式 1) で翻訳、空白する必要があります。 蛍光(t) =平均(Tr1(t) – Tr1(t0) Tr2(t) – Tr2 (t0) Tr3(t) – Tr3(t0))-平均(TBr1 (t) – TBr1(t0) TBr2(t)- TBr2( t0) TBr3(t) – TBr3(t0)) (1) 注: これはスプレッドシート関数としてなされるべきであります。エラーの適切な伝播は、各時間ポイントも計算する必要があります。 グラフ時間の関数として各処理の補正後の蛍光 図 2: 時間の関数として蛍光データを修正します。蛍光測定相対蛍光ユニット (RFU)エシェリヒア属大腸菌NEB5α によって放出される HgIIの追加と時間をかけて pUC57merR Pp (誘導ひずみ) を抱いて (0 12.5 nM) 嫌気性の条件の下で。蛍光だった 3 技術の平均が 37 ° C でレプリケートされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 注: あるない 0 nM Hg 値グラフと他のすべての水銀濃度が 0 非表示されて nM 水銀治療の空白が。したがって、0 nM Hg x 軸とすべての肯定的な蛍光を表します任意の変数を与えられる Hg から蛍光。なくこの方法で蛍光、空白を省略可能ですが、テスト変数がバック グラウンド蛍光蛍光曲線は誤解を招く蛍光曲線を与える (すなわち、溶解有機物自体が蛍光を発するし、あるかないです。治療細胞および溶存有機物濃度、溶存有機物を含む空白増える蛍光信号)。 蛍光ピークを定量化します。定量化可能な蛍光ピークが通常ターミナル電子受容体としてすべて 200 μ M 硝酸態窒素の消費に費やされるエネルギーを表す 2.5-4 時間後発生します。このピークは、定量化する必要があり、その特定の治療の最終の蛍光値を表します。注: イベントの蛍光ピークが観測されない (すなわち、 Hg バイオアベイラビリティ)、治療コントロールの蛍光ピークの時点での蛍光性 (すなわち、ない追加変数または 5 nm Hg) 定量化する必要があります。また、治療では, 蛍光誘導が、蛍光はよく定義されたピークを生成しません、O2などのより高い親和性電子受容体の可能性が高い汚染があるし、措置のトレースを削除するにはすべてのソリューションと実験から酸素を再度実行する必要があります。