一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法

1. 生长介质和曝光介质的制备 要使250毫升的生长介质:注意: 如果跟踪元素 #1 解决方案和#2 解决方案的跟踪元素已准备好, 请跳到步骤1.1.5。 在干净的体积瓶 (200 ml) 中制备微量元素 #1溶液, 以包含 1.5 x 10-3 mna 2 moo 4、 6.5 x 10-4 mna 2seo 4、5 x 10-3 m h3 bo的最终摩尔 3, 0.1 m naoh。注意: 强碱 (naoh) 具有腐蚀性。在称量试剂时, 一定要确保最终的摩尔度代表关键的微量元素;莫、赛、b。 在无菌场下, 使用0.22μm 聚醚磺酮注射器过滤器在清洁/无菌塑料-聚四氟乙烯 (ptfe) 瓶中进行消毒。 在干净的体积瓶 (200 ml)中制备微量元素 #2 溶液, 以包含 0.01 m mnso 4、5 x 10-4 m MnSO4、3.25 x 10-3 m ccl 2、6.25 x 10-3 m 镍基的最终摩尔2, 和 0.1 m h2 so4。注意: 强酸 (h2so4) 具有腐蚀性.在称量试剂时, 一定要确保最终的摩尔度代表关键的微量元素;锰、锌、公司和 ni。 在无菌区下, 使用0.22μm 聚醚磺酮注射器过滤器在干净的玻璃瓶中进行消毒。 在无菌场下, 在清洁/无菌玻璃瓶中 (最少250毫升);加入200毫升超纯水 mL 最小盐的 42.5 ml (5倍;见材料表), 2.5 ml 的 2 m 葡萄糖, 125μl 的 2 m mgso 4, 1200 微米的 0.6 m thiaminehcl, 来自冷冻 (-20°c) 的 aliquot, 1.25 ml 的 4 m nno3, 70μl 的 0.075 m l-亮素/l-异丙菊/代氨酸溶液,250μl 微量元素 #1, 250μl的微量元素 #2, 250μl 0.01 m edta 钠盐。注: 所有步骤1.1.5 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。超纯水可以使用高压灭菌器进行消毒。 从1.1.5 的步骤中取出现在含有溶液的玻璃瓶, 松散地封盖, 通过厌氧室气闸循环。 在厌氧室中, 在 0.2 m h2so 4 中加入15μl 的 0.225 mfeso4 , 紧紧地盖瓶, 摇匀, 直到所有白色沉淀物消失。注: 所有步骤1.1.7 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。将 0.225 m feso4放入厌氧室, 放入0.2 m h 2 so 4 中。 从瓶子上取下瓶盖, 等待1分钟才能换气, 从瓶子上更换瓶盖, 然后用力摇一摇。重复此步骤一次。 将瓶盖紧紧地固定在瓶子上, 从厌氧室取出, 并将瓶子存放在冰箱 (4°c) 中, 直至使用。 应通过重复 1.1.5 1.1.9 的步骤, 每周重塑一次增长媒介。 要在 2 x 50 毫升锥形无菌聚丙烯离心管中制备100毫升的曝光介质:注意: 我们建议在接触检测当天准备接触介质, 以最大限度地降低污染风险, 但可以提前制作并将其存放在冰箱中。 在厌氧室里每50毫升离心管加入42毫升厌氧超纯水, 350μl 1 m 钠β-gylcerfice 从冷冻 (-20°c) 的 aliquot, 2 毫升 1 m mL 游离酸, 50μl 1 m (nh 4)2so4 , 25μl 的 2 m 葡萄糖, 300μl 的 2.5 m koh, 200μl 的 2.5 m naoh。注: 所有步骤1.2.1 的试剂应事先制备, 并使用0.22μm 聚醚磺酸注射器过滤器进行过滤。超纯水可以使用高压灭菌器进行热灭菌。2.5 m naoh 和 2.5 m naoh 必须储存在塑料瓶中。列出的所有试剂必须存放在厌氧室, 但β-基地磷酸钠除外, 它将储存在 (-20°c) 的冰柜中。一般来说, 最好的做法是将所有塑料或玻璃部件和容器留在厌氧室几天, 以确保没有氧气痕迹。 封盖50毫升离心管, 摇匀, 并取出10毫升的脂肪来测量 ph 值。在25°c 时, 此曝光介质的测量 ph 值必须始终为7.00±0.02.如果 ph 值不能在此范围内测量, 请重新调整添加的 2.5 m koh 的体积, 以纠正此问题。注意: 切勿用 ph 探头滴定溶液以纠正 ph 值。ph 探头代表接触介质的污染源. ph 值必须始终是1.2.1 的步进中添加的试剂的产物。 准备一个 5-10 mmnno 3 库存溶液, 并留在厌氧室, 以便在接触试验期间使用。注意: 它更容易稀释一个更集中的初级 nno3标准, 而不是使 5-10 mmnno 3主要标准。 2. 制定汞和镉标准。 在 0.2 m h2so4中制备4-8μm 汞 (hgii) 溶液。 在 0.2 m h2so 4 中制备毫米 (1-10mm) hgcl2、hgno3或 hgso4溶液, 以制备汞2 +标准.注意: 汞毒性很强, h2so-4具有腐蚀性.使用所有必需的个人防护设备在通风柜中操作。 在聚四氟乙烯瓶中, 从2.1.1 稀释标准。转化为 0.2 mh 2 so4, 以获得 4-8μmhh2 +范围内的浓度。注: 所使用的酸必须是分析级h2so4。 应使用汞分析仪 (见材料表) 验证2.1.2 的汞浓度。注: 可使用其他方法来验证汞浓度。 在 10mm h2 so 4 中制备 10μm cdii 溶液. 在 0.1 m h2 so 4 中制备 cdcl2的主要标准 (10-50 mm 范围, 用于精确称药粉末)。 在一系列的系列稀释在清洁酸洗20毫升硼硅酸盐玻璃瓶与黑色酚醛螺盐螺丝盖与 ptfe 面橡胶衬里, 稀释标准从2.2.1 到 10μm cd2 +。确保 h2so-4 在随后的每一次连续稀释中的浓度保持在 10 mm。 3. 厌氧暴露检测生物传感器的制备 平板汞诱导生物传感器 (e. 存在 pic57mer-pp爆bfp 的大肠杆菌 neb5 α) 和本构表达的生物传感器 (大肠杆菌 neb5α窝藏 puc19balch-ppfbfp) 从-80°c 的冷冻库到含有 120 ugl 安培的 lysogeny 兄弟板上。有关这些生物传感器17的生产的详细信息, 请参阅我们之前发表的作品。 下午4:30 至 5点, 在 lb (+ 放大器) 10 毫升中接种培养物, 并在一夜之间生长。注: 从一个盘子开始, 需要2天的时间为接触检测准备厌氧培养 (即, 从周一下午 (下午4时至 5时) 开始的培养将在周三中午左右为接触检测做好准备) 。以下步骤是在接触试验当天准备培养物所需的微生物技术。 从板培养中提取一个菌落, 并在无菌培养管中加入 10ml lysogeny broth (lb), 并加入100μml 的氨匹西林钠盐 100 mgml 库存溶液 (最终浓度为 210 ug/ml 放大器)。 将培养物放入孵化器中, 在 + 37°c 下过夜生长, 摇号为220转/分。 第二天早上9点至 10点, 重新悬浮培养, 全天无氧生长 (20% 接种)。 将培养物从孵化器 (步骤 3.2.1) 和生长介质(步骤 1.1.9) 进入厌氧室。 在无菌的秃头管中加入8毫升的新鲜生长培养基和氨匹西林 (210μg/ml)。 收集2毫升的隔夜培养物, 并转移到2毫升的微离心管。以 10, 000 rcf 步骤离心 90秒, 倾倒上清液并在2 毫升新鲜生长介质中重新悬浮。在含有8毫升新鲜生长培养基和氨匹西林的巴氏管中加入悬浮培养物。 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从厌氧室取出, 放在孵化器中, 在 + 37°c 下无氧生长至 3-5 pm, 在220转/分时晃动。 在下午3点到5点之间, 在新鲜培养基中进行1% 的厌氧接种,并在一夜之间生长。 将支接管 (步骤 3.3.4) 与生长介质一起放入厌氧室。在无菌支管中加入100μl培养物, 加入10毫升的新鲜培养基(1% 接种), 并在无菌的支接管中加入放大器 (210 ug/ml 放大器)。 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从厌氧室取出, 放置在孵化器中, 在 + 37°c 下过夜, 在220转/分的情况下晃动。 在上午9点到10点之间, 重新悬浮培养, 全天无氧生长 (20% 接种疫苗)。 将培养物从孵化器 (步骤 3.4.1) 和生长介质(步骤 1.1.9) 进入厌氧室。 在无菌的秃头管中加入8毫升的生长培养基和氨匹西林 (210 ug/ml 放大器)。 收集2米的隔夜生长培养物, 并转移到2毫升的微离心管。以 10, 000 x g 离心 90秒, 倾倒上清液, 并在2 毫升的新鲜生长介质中重新悬浮。在含有8毫升新鲜生长培养基和氨匹西林的巴氏管中加入悬浮培养物。 使用无菌技术, 小心地将橡胶塞子放在支接管上。从室中取出并放置在孵化器中, 在 + 37°c 时无氧生长, 在220转/分时晃动。 使用分光光度计 (步骤 3.5.4) 监测培养物的生长, 直到达到od600的 0.6.每次 od 阅读前一定要进行漩涡培养。注意: 此步骤需要 3-4小时, 在此期间应准备接触介质(步骤 1.2) 以及接触分析(步骤 4.1)。 当培养达到od600 0.6 (±0.1) (3-4小时的预期生长) 时停止生长。 将导管放入厌氧室(步骤 3.6), 并将培养物转移到 2x 2毫升微型离心管中。以 10, 000 x g 离心 90秒, 倾倒上清液, 并在 2 x 2 毫升的新鲜接触介质中重新悬浮。 重复清洗步骤3.7.1。一次, 以消除任何生长介质的痕迹。 将细胞培养的两个微离心管 (步骤 3.7) 结合成一个7毫升 ptfe 标准小瓶, 以获得要用于暴露检测的生物传感器库存(步骤 4)。注意: 在使用前, 请务必将生物传感器库存通过彻底而轻轻的来回移液混合。该方法可能会在这里暂停长达一个小时。 4. 曝光检测 设计板布局。注意: 在开始接触试验之前, 请务必计算所有移液值和库存.如何正确设计实验以及要包括哪些控件在文本中进行了详细说明。此外, 如果厌氧监测器上标明的厌氧室有氧气, 则不应开始实验。 根据96井模板设计板材布局。要在3的技术复制中运行实验, 这将允许32种不同的处理, 最好用 4 x 8 网格来设置小瓶 (参见图 1)。 图 1:96 井板 (左) 和相应的 4 x 8 栅格包含 ptfe 小瓶 (右), 将转移到板上.请点击这里查看此图的较大版本. 注: 在用汞诱导生物传感器测试汞吸收变量的作用时; 每个变量都需要两种处理方法:处理(生物传感器 + 汞 + 变硝酸盐) 及其处理空白(生物传感器 +可变 + 硝酸盐)。在使用本构生物传感器测试变量对细胞生理的作用时, 每个变量都需要两种处理方法:处理(生物传感器 + hg + 可变硝酸盐) 和处理空白处理 ( 生物传感器 + 变量 + hg)。汞可能会被镉所取代。在执行校准曲线时, 汞或镉将成为变量。本构和诱导生物传感器不需要同时运行 (在同一板块布局中)。表 1提供了测试镁 (可变) 浓度范围时板布局和相应的 4 x 8 网格的模板示例。 1 2 3个 4个 5 6 7。 8 9 10 11 12 a 汞诱导生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0 毫米镁 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 0 mm mg 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0 毫米镁 本构生物传感器 + hg + 0 mm mg B 汞诱导的生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0.1 毫米镁 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 0.1 mm mg 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 0.1 mm mg 本构生物传感器 + 汞 + 0.1 mm mg C 汞诱导的生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 1 毫米镁 本构生物传感器 + hg + 1 毫米镁 D 汞诱导生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 10 毫米镁 汞诱导生物传感器 + 硝酸盐 + 10mm mg 本构生物传感器 + 汞 + 硝酸盐 + 10 毫米镁 本构生物传感器 + 汞 + 10 毫米镁 e 表 1: 使用生物传感器在镁梯度 (0-10 mm) 上测试汞生物利用度 (5 nm) 的示例平板布局 根据检测板布局设置 4 x 8 网格。 将7毫升聚四氟乙烯标准小瓶放入托盘中。注: 聚四氟乙烯小瓶在使用前应进行酸洗/加热。瓶只能通过操纵小瓶的外部来处理。 在每个小瓶中, 添加与每个治疗相对应的曝光介质体积。注: 在总容量为 2, 000μl (2 毫升) 的接触中, 添加的接触介质将是:接触介质μl = 2, 000μl-处理 (空白) μl (例如,接触介质μl = 2, 000-100μl (生物传感器) –40μl (硝酸盐)-100 微米 (hhg μl)a–100μl (可变 (例如, mgso4) = 1660μl)。确保测试变量添加的体积不超过最终体积的 5% (100μl)。 在每个小瓶中, 添加相应体积的化学变量的溶液, 以便根据板布局进行测试。 从步骤1.3 开始, 将硝酸盐添加到每个小瓶中, 使最终浓度为200μm (40-80μl)。排除此步骤用于本构生物传感器处理空白。 从步骤2.1 或2.2 中, 根据板材布局在小瓶中添加汞 (在测试变量时使用 5nm ) 或 cd (在测试变量时为 300 nm )。不包括汞诱导生物传感器处理空白的这一步骤。 使用汞时, 取4-8μm库存, 摇匀。将暴露介质中的溶液稀释至100-250 nm的暴露介质, 制成有效的汞溶液。从这个工作解决方案中, 在所需的小瓶中添加汞。在这种情况下, 汞的校准曲线从0到 12.5 nm 不等。注: 在测试变量对汞或镉生物利用度的影响时, 请确保 [汞] 或 [cd] 在所有处理过程中保持不变。添加汞或镉时, 一定要使用一个移液器尖端, 但千万不要接触小瓶中的接触介质。 手动在轨道运动中晃动。注意: 根据汞或镉指定溶液所需的时间, 实验现在可能会暂停。如果离开超过一个小时, 将聚四氟乙烯瓶盖放在聚四氟乙烯瓶上, 以防止蒸发/污染。 轻轻的移液器生物传感器来回库存, 以确保均匀性。在每个小瓶中添加100μl 的生物传感器. 手动晃动。 准备板读取器以热身,以便按照以下标准进行读取: 37°C 温度、每 2.5-5分钟读取一次、两次读取时的动态运行时间和使用以下标准进行荧光测量. 荧光激发440纳米和 500 纳米的发射。 从 4 x 8 网格中的每个 ptfe 小瓶中的移液器200μl进入96井板 (黑色, 96 井透明底非结合表面微板) 的相应井。移液器来回 5次, 然后转移每200μl。注意: 不要丢弃移液器尖端, 而是将移液器尖端放在 ptfe 小瓶中, 以跟踪移液器的进度。 将96井板放入盘式读取器的托盘中, 然后将盖子放在96井板上并开始检测。 5. 量化数据 每次处理的荧光在每个时间点必须针对每个单独的井噪声进行校正, 并将其抹掉到处理的空白处. 每个处理(t) 的每个时间点 (t) 的荧光必须被转换为每个井的第一个时间点的初始荧光 (t0), 然后在 3个处理复制过程中的平均值 (r1-r 3)). 然后, 必须将这种治疗平均值抹掉到以同样方式翻译的平均治疗空白(tb) (公式 1)。 荧光(t) =平均值(t r1(t) –tr1 (t 0), tr1(t) –t r1 (t0), tr3(t) –t r3(t0)) –平均值( tbr1 (t) –tbr1 (t0), tbr1(t) –tb r1( t0), tbr3(t) – tbr3(t0)) (1) 注意: 这应该作为一个电子表格函数。还应该为每个时间点计算错误的正确传播。 将每次处理的修正荧光绘制为时间的函数 图 2: 校正荧光数据作为时间的函数.随着时间的推移, 随着时间的推移, 在厌氧条件下添加了 hg ii (0-12.5 nm), 以大肠杆菌 neb5α发射的相对荧光单位 (rfu) 测量.在37°c 下, 荧光是3个技术复制的平均值。请点击这里查看此图的较大版本. 注: 图表上没有 0 nm 汞值, 所有其他汞浓度均被作为处理空白, 被划分为 0 nm 汞。因此, 0 nm 汞代表 x 轴, 任何正荧光表示来自汞的荧光。它是可选的, 不空白荧光以这种方式, 但荧光曲线将给出误导性荧光曲线, 如果变量测试有背景荧光 (即, 溶解的有机物本身将荧光, 如果没有处理空白含有仅细胞和溶解有机物, 增加溶解性有机物浓度会增加荧光信号)。 量化荧光峰值。可量化的荧光峰值通常发生在 2.5-4小时后, 即消耗所有200μm 硝酸盐作为终端电子受体所消耗的能量。这个峰值应该被量化, 并代表该特定处理的最终荧光值。注: 如果没有观察到荧光峰值 (即没有汞的生物利用度), 则应量化在控制的荧光峰值点 (即没有添加变量或 5nm hg) 的处理荧光。或者, 如果在处理中有荧光诱导, 但荧光不会产生一个明确定义的峰值, 则可能会污染较高的亲和力电子受体, 如 o2, 并应采取措施去除所有溶液中的氧气和实验必须再次进行。