Noden og notochordal plate er forbigående signalering arrangørene utvikle mouse embryoer som kan visualiseres ved hjelp av flere teknikker. Her vi beskrive i detalj hvordan du utfører to teknikker for å studere struktur og morphogenesis: 1) skanning elektronmikroskop (SEM); og 2) hele mount immunofluorescence (WMIF).
Etter implantasjon musen embryoet gjennomgår store figurendringene etter initiering av gastrulation og morphogenesis. Et kjennetegn på morphogenesis er dannelsen av forbigående arrangørene, node og notochordal plate, celler som har gått gjennom den primitive strek. Riktig dannelsen av disse signalnettverk sentre er avgjørende for utviklingen av kroppen planen og teknikker for å visualisere dem er av høy interesse for musen utviklingsmessige biologer. Noden og notochordal plate ligger på ventral overflaten av gastrulating mouse embryoer rundt embryonale dag (E) 7.5 utvikling. Noden er en cup-formet struktur som celler har en enkelt slanke Flimmerhår hver. Riktig subcellular lokalisering og rotasjon av flimmerhårene i noden gropen bestemmer venstre høyre asymmetri. Notochordal plate cellene har enkelt flimmerhårene men kortere enn noden cellene. Notochordal platen danner notochord som fungerer som en viktig signalnettverk arrangør for somitogenesis og nevrale mønstre. Fordi cellene i noden og notochordal plate transiently finnes på overflaten og ha flimmerhårene, kan de visualiseres ved hjelp av skanning elektronmikroskop (SEM). Blant andre teknikker som brukes til å visualisere disse strukturene på cellenivå er hele mount immunofluorescence (WMIF) bruker antistoffer mot proteiner som er svært uttrykt i noden og notochordal plate. I denne rapporten beskriver vi våre optimalisert protokoller for å utføre SEM og WMIF av node og notochordal plate i utviklingsland mouse embryoer å hjelpe i vurderingen av vev form og mobilnettet organisasjon i vill-type og gastrulation mutant embryoer.
Gastrulation og tilhørende Morfogenetiske bevegelser er avgjørende for å forme det mus embryoet1. Endringene i mobilnettet form og organisasjonen under morphogenesis diktere posisjonelle informasjon for å regulere celle skjebne og også tillate de påfølgende signalveier nøyaktig utføre sine funksjoner til å spre den nyopprettede bakterie lag1. Dannelsen av organisering strukturer og signalering sentre som noden og notochord er viktig for gjennomføring av de utviklingsmessige programmet2. Utviklingsmessige biologer har brukt en rekke teknikker for å studere morphogenesis av disse strukturene, mest bemerkelsesverdige som er bruk av mobilnettet journalister og live ex vivo for å følge dynamikken i mobilnettet og subcellular atferd2 ,3,4. I denne rapporten vi fokusere på å beskrive detaljene for våre optimalisert protokoller for to av disse teknikkene: skanning elektronmikroskop (SEM) og hele mount immunofluorescence (WMIF), som var og er fortsatt instrumental i å studere morphogenesis for noden og notochordal platen, forløperen til notochord.
Mus embryonale noden er en Dråpeformede kopp av celler som er plassert på ventral overflaten av musen embryoet rundt tidlig til sen hodet kaste stadier under gastrulation og morphogenesis (embryonale dag, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal platen utgår morphologically peke fra node3. Hver celle i noden og notochordal plate er preget av et enkelt Flimmerhår som stikker på utsiden, som er lengre i noden celler men lengden varierer med utviklingen scene2. Rotasjon av flimmerhårene i noden gropen har vist seg å være viktig for signalering som bestemmer venstre høyre asymmetri4. Notochordal platen er forløperen til notochord, signalnettverk sentrum som er viktig for mønstre av de tilstøtende somites og overliggende medfødte3.
På grunn av attributtene for plassering (overflate), form (cup) og besitter forskjellige ytre cellulære strukturer (flimmerhårene), er SEM tradisjonelt brukt til å visualisere noden og notochordal plate og studere deres dannelse og struktur2, 7. SEM brukes også til å studere endringer i strukturen i noden selv eller flimmerhårene på cellene i mutasjoner som påvirker gastrulation, morphogenesis, samt flimmerhårene formasjon8,9,10. SEM er en teknikk som bruker en fokusert stråle av elektroner avhøre topologisk ultrastructure av den ytre overflaten av materialer som biologiske prøver11. Prøven er vanligvis fast, tørket og deretter frese-belagt med metaller for observasjon under scanning elektron mikroskop som vi beskriver i trinn 1.
WMIF er en flekker teknikk å visualisere genet produkter, for eksempel proteiner, i tre-dimensjoner (3D). WMIF vev, organer eller hele organismer gir romlig informasjon om distribusjon av signalet og formen på den resulterende strukturen i 3D. Teknikken er basert på feste prøven deretter flekker det med fluorescerende conjugates. Mus embryo ~ E7.5 er liten og gjennomsiktig og derfor ideell for WMIF-protokoller for å visualisere noden og notochordal plate. For eksempel transkripsjon faktoren Barchyury (T) er uttrykt i kjerner av node og notochordal plate, og i mindre grad i den primitive strek, rundt E7.5-E8 embryonale utvikling og godt fungerende antistoffer mot T av WMIF er kommersielt tilgjengelig og muliggjøre flekker prosedyren. Cellene i noden og notochordal plate er også preget av trange apikale flater, som vender mot utsiden og dermed kan være farget med fluorescens-konjugerte Phalloidin merket F-utgangen på de apikale constrictions. Bruker disse reagensene som eksempler, gir kombinasjonen av T og F-utgangen farging av WMIF en representasjon av node og notochordal plate i 3D i gastrulating mouse embryoer som vi viser i trinn 2- 8. Markører for flimmerhårene, som ARL13B eller acetylated tubulin, i tillegg til andre markører av node og notochordal plate, for eksempel FOXA2, kan imidlertid også brukes til å utføre WMIF på utvikle musen embryo3,4.
Vi har vist at striatin-samspill protein 1 (STRIP1) er avgjørende for vanlig gastrulation og morphogenesis i musen embryoet8. STRIP1 er en kjernekomponent i striatin-samspill phosphatases og kinaser komplekser (STRIPAK), som vi og andre har innblandet i utgangen cytoskjelett organisasjon8,12. En alvorlig defekt i Strip1 mutant embryoer er i dannelsen av aksial mesoderm (node og notochordal platen) og utvidelse av antero-bakre kropp aksen. Vi har brukt SEM og WMIF for å analysere noden og notochordal plate i vill-type (WT) og Strip1 mutant embryo som vi viser i Representant resultater og tilsvarende tall.
I dette arbeidet viser vi hvordan du utfører SEM og WMIF å visualisere mus embryonale noden og notochordal plate. Den lille størrelsen på gastrulating mouse embryoer ~ E7.5 og tilstedeværelsen av disse strukturene på overflaten gjør dem ideelle til å studere med teknikker beskrevet2,7,8. Tilgjengeligheten av god antistoffer, for eksempel T og flimmerhårene markører, gir utmerket 3D-informasjon ved hjelp av WMIF på strukturen, organiseringen og dannelsen av disse viktige embryonale arrangørene8.
Fordi mus embryonale utvikling fortsetter på en svært rask tempo og node og notochordal plate finnes bare transiently på overflaten av fosteret, er timing viktig for disse eksperimentene2,3. For eksempel er 2-4 somite embryoer bra for SEM analyse av en moden noden grop med lang flimmerhårene. I mye tidligere eller senere embryoer (for eksempel 12 h før eller etter), kan noden ikke være til stede på overflaten. WMIF er litt mer fleksibel i denne forbindelse men strukturene seg er også forbigående under utvikling og tidspunktet i dette tilfellet avhenger av forskernes interesser.
Renheten av reagensene er også viktig for suksessen til disse teknikkene, spesielt i undersøkelser av ultrastructure av SEM. Tiny urenheter det holde seg til embryoene vanligvis resultere i store gjenstander.
Vi har testet to ulike metoder for fosteret fiksering for SEM bruke halve Karnovsky bindemiddel (2,5% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde og 0.1 M cacodylate buffer) og en enklere 2,5% glutaraldehyde i 1 x PBS. Vi foretrekker å bruke glutaraldehyde og PBS bindemiddel som beskrevet i trinn 1, men vi og andre har også brukt den halve Karnovsky bindemiddel vellykket for SEM.
Vi har også sammenlignet to metoder for tørking embryoene for SEM og fant ingen forskjell i kvaliteten på prøven ved hjelp av en kritisk punkt tørketrommel eller HMDS som beskrevet i trinn 1 og rapportert andre steder14.
Trinn 2, vi testet innebygging av embryo etter siste vask trinnene i 1% lavt Smeltepunkt agarose montert på en 35 mm glass-bottom rett og deretter topping det med ~ 10 µL av montering medium. Denne innebygging metoden fungerer og bevarer den opprinnelige 3D strukturen av embryoet og tilhørende strukturer; multiphoton mikroskop er imidlertid nødvendig å image prøven fordi vanlige AC confocal mikroskop ikke kan nå så dypt inn i intakt embryo (~ 1 mm).
Vi tror at disse to teknikkene gir utfyllende informasjon om strukturen i noden og notochordal platen under normal utvikling og mutanter som viser feil i dannelsen av disse strukturene.
The authors have nothing to disclose.
H.B. støttes av oppstart finansiering fra medisinske fakultet og SFB829 av universitetet i Köln. C.X. støttes av DFG gi BA 5810/1-1. Vi vil gjerne takke Imaging fasilitetene på CECAD forskningssenter og Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Vi takker Joaquín Grego-Bessa (spanske National Center for hjerte forskning, Madrid, Spania) for hans innsikt på montering av embryo for WMIF.
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |