नोड और notochordal प्लेट माउस भ्रूण है कि कई तकनीकों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है के विकास में क्षणिक संकेत आयोजकों रहे हैं । यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे तकनीकों के दो करने के लिए अपनी संरचना और morphogenesis अध्ययन: 1) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM); और 2) पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF) ।
बाद आरोपण माउस भ्रूण gastrulation और morphogenesis की दीक्षा के बाद प्रमुख आकार बदलता है । morphogenesis की एक बानगी क्षणिक आयोजकों का गठन है, नोड और notochordal प्लेट, कोशिकाओं है कि आदिम लकीर के माध्यम से पारित कर दिया है से । इन संकेत केंद्र के समुचित गठन शरीर की योजना और तकनीकों के विकास के लिए आवश्यक है उंहें कल्पना उच्च ब्याज की माउस विकास जीव के लिए कर रहे हैं । नोड और notochordal प्लेट भ्रूण दिवस के आसपास gastrulating माउस भ्रूण के ventral सतह पर झूठ (ई) विकास के ७.५ । नोड एक कप के आकार का संरचना है जिसकी कोशिकाओं को एक एकल पतला पपनी प्रत्येक अधिकारी है । उचित उपसेलुलर स्थानीयकरण और नोड गड्ढे में cilia के रोटेशन बाएं सही विषमता निर्धारित करता है । notochordal प्लेट कोशिकाओं को भी एकल cilia के अधिकारी हालांकि नोड कोशिकाओं की तुलना में कम है । notochordal प्लेट notochord जो somitogenesis और तंत्रिका patterning के लिए एक महत्वपूर्ण संकेत आयोजक के रूप में कार्य करता है रूपों । क्योंकि नोड और notochordal प्लेट की कोशिकाओं को सतह पर क्षणिक मौजूद है और cilia के अधिकारी, वे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । अन्य तकनीकों में सेलुलर स्तर पर इन संरचनाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF) अत्यधिक नोड और notochordal प्लेट में व्यक्त कर रहे हैं कि प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर रहा है. इस रिपोर्ट में, हम हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन SEM और माउस भ्रूण के विकास में notochordal प्लेट के WMIF करने के लिए ऊतक के आकार और वंय-प्रकार और gastrulation उत्परिवर्ती भ्रूण में सेलुलर संगठन के आकलन में मदद करते हैं ।
Gastrulation और साथ morphogenetic आंदोलनों माउस1भ्रूण को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण हैं । morphogenesis के दौरान सेलुलर आकार और संगठन में परिवर्तन सेल भाग्य को विनियमित करने के लिए स्थिति जानकारी हुक्म और भी आगामी संकेत रास्ते ठीक करने के लिए नए गठन रोगाणु परतों1विविधता को अपने कार्यों का प्रदर्शन करने की अनुमति. क्षणिक आयोजन संरचनाओं और सिगनलिंग केन्द्रों जैसे नोड और notochord का गठन विकासात्मक कार्यक्रम2के निष्पादन के लिए आवश्यक है । विकास जीव तकनीक की एक किस्म का इस्तेमाल किया है इन संरचनाओं के morphogenesis अध्ययन, सबसे उल्लेखनीय जिनमें से सेलुलर पत्रकारों और जीने के पूर्व vivo इमेजिंग का उपयोग करने के लिए सेलुलर और सेलुलर व्यवहार 2 में गतिशीलता का पालन है ,3,4. इस रिपोर्ट में, हम इन तकनीकों में से दो के लिए हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल के विवरण का वर्णन पर ध्यान केंद्रित: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF), जो थे और अभी भी नोड के morphogenesis का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई और notochordal थाली, notochord के प्रणेता ।
माउस भ्रूण नोड एक अश्रु के आकार का कप है कि माउस भ्रूण के ventral सतह पर जल्दी देर सिर मोड़ो के आसपास स्थित है gastrulation और morphogenesis (भ्रूण दिवस, ई 7.5-E8)2,5के दौरान चरणों, 6,7. notochordal प्लेट आकृति विज्ञान नोड3से पूर्वकाल से उत्पन्न होती है । नोड और notochordal प्लेट में प्रत्येक कोशिका एक एकल पपनी कि बाहर है, जो अब नोड कोशिकाओं में है, लेकिन जिसकी लंबाई विकास चरण2के साथ बदलता है के लिए बहर की विशेषता है । cilia के रोटेशन नोड गड्ढे में संकेत है कि बाएं सही विषमता निर्धारित करता है के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है4। notochordal प्लेट notochord, संकेतन केंद्र है कि आसंन somites और के पैटर्न के लिए महत्वपूर्ण है के अग्रदूत साबित तंत्रिका ट्यूब3…
क्योंकि स्थान की विशेषताओं (सतह), आकार (कप) और अलग बाहरी सेलुलर संरचनाओं रखने (cilia), SEM पारंपरिक नोड और notochordal प्लेट कल्पना और उनके गठन और संरचना2अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 7. SEM भी gastrulation, morphogenesis, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cilia गठन8,9,10का प्रभाव है कि उत्परिवर्तन में अपनी कोशिकाओं पर नोड या cilia की संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । SEM एक तकनीक है कि इलेक्ट्रॉनों की एक केंद्रित बीम का इस्तेमाल करता है ऐसे जैविक नमूनों11के रूप में सामग्री की बाहरी सतह के टोपोलॉजिकल ultrastructure पूछताछ । नमूना आमतौर पर तय, सूख गया है और फिर धूम-एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए धातुओं के साथ लेपित के रूप में हम चरण 1 में वर्णन ।
WMIF एक दाग तकनीक है जैसे प्रोटीन के रूप में जीन उत्पादों, कल्पना, तीन आयामों (3 डी) में । ऊतकों, अंगों या यहां तक कि पूरे जीवों के WMIF संकेत के वितरण और 3 डी में परिणामी संरचना के आकार के बारे में स्थानिक जानकारी प्रदान करता है । तकनीक नमूना तो यह फ्लोरोसेंट conjugates के साथ दाग फिक्सिंग पर आधारित है । माउस भ्रूण ~ ई 7.5 छोटे और पारदर्शी और इसलिए WMIF प्रोटोकॉल नोड और notochordal प्लेट कल्पना के लिए आदर्श होते हैं । उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन फैक्टर Barchyury (टी) नोड और notochordal प्लेट के नाभिक में व्यक्त किया जाता है, और आदिम लकीर में एक हद तक कम करने के लिए, ई 7.5 के आसपास-भ्रूण विकास के E8 और WMIF द्वारा टी के खिलाफ अच्छा काम एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से कर रहे हैं उपलब्ध है और धुंधला प्रक्रिया संभव बनाते हैं । नोड और notochordal प्लेट की कोशिकाओं को भी सीमित शिखर सतहों, जो बाहर का सामना और इस तरह प्रतिदीप्ति-संयुग्मित Phalloidin के साथ दाग हो सकता है की विशेषता है Actin कसना में एफ शिखर निशान । उदाहरण के रूप में इन रिएजेंट का प्रयोग, टी और एफ के संयोजन-Actin WMIF द्वारा धुंधला gastrulating माउस भ्रूण में 3 डी में नोड और notochordal प्लेट का प्रतिनिधित्व प्रदान करता है के रूप में हम चरण 2 8में प्रदर्शन । हालांकि, ऐसे ARL13B या acetylated tubulin के रूप में cilia के मार्करों, के रूप में अच्छी तरह से नोड और notochordal प्लेट के अंय मार्करों के रूप में, जैसे FOXA2, भी माउस भ्रूण3,4के विकास पर WMIF प्रदर्शन किया जा सकता है ।
हमें पता चला है कि striatin-बातचीत प्रोटीन 1 (STRIP1) माउस भ्रूण8में सामांय gastrulation और morphogenesis के लिए आवश्यक है । STRIP1 striatin के एक मुख्य घटक है phosphatases और kinases परिसरों (STRIPAK), जो हम और दूसरों को actin cytoskeleton संगठन8,12में फंसा है बातचीत । Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में एक प्रमुख दोष अक्षीय मध्य त्वक स्तर (नोड और notochordal प्लेट) और antero-पीछे शरीर धुरी के विस्तार के गठन में है । हम SEM और WMIF का इस्तेमाल किया है नोड और जंगली में notochordal प्लेट प्रकार (WT) और Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण का विश्लेषण के रूप में हम प्रतिनिधि परिणाम और इसी आंकड़े में दिखाते हैं ।
इस काम में, हम प्रदर्शन कैसे SEM और WMIF करने के लिए माउस भ्रूण नोड और notochordal प्लेट कल्पना । gastrulating माउस भ्रूण के छोटे आकार ~ ई 7.5 और सतह पर इन संरचनाओं की उपस्थिति उन्हें2,7,8वर्णित तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए आदर्श बनाते हैं । ऐसे टी और cilia मार्करों के रूप में अच्छे एंटीबॉडी की उपलब्धता, उत्कृष्ट 3 डी संरचना, संगठन और इन आवश्यक भ्रूण8आयोजकों के गठन पर WMIF का उपयोग कर जानकारी देता है ।
क्योंकि माउस भ्रूण विकास बहुत तीव्र गति से आगे बढ़ता है और नोड और notochordal प्लेट भ्रूण की सतह पर ही क्षणिक रूप से मौजूद हैं, समय इन प्रयोगों की सफलता के लिए आवश्यक है2,3. उदाहरण के लिए, 2-4 somite भ्रूण लंबे cilia के साथ एक परिपक्व नोड गड्ढे के SEM विश्लेषण के लिए अच्छा कर रहे हैं । बहुत पहले या बाद में भ्रूण (उदाहरण के लिए, 12 घंटे पहले या बाद में), नोड सतह पर मौजूद नहीं हो सकता है । WMIF इस संबंध में थोड़ा और लचीला है लेकिन संरचनाओं खुद भी विकास के दौरान क्षणिक रहे है और इस मामले में समय शोधकर्ताओं के हितों पर निर्भर करता है ।
रिएजेंट की शुद्धता भी इन तकनीकों की सफलता के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से SEM द्वारा ultrastructure की जांच में । छोटे अशुद्धियां कि भ्रूण के लिए छड़ी आमतौर पर विशाल कलाकृतियों में परिणाम है ।
हम आधा है Karnovsky निर्धारण (२.५% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde और ०.१ एम cacodylate बफर) और 1x पंजाब में एक सरल २.५% glutaraldehyde का उपयोग कर SEM एक के लिए भ्रूण निर्धारण के दो अलग तरीकों का परीक्षण किया है । हम चरण 1 में वर्णित के रूप में glutaraldehyde और पंजाब निर्धारण का उपयोग करना पसंद करते हैं, तथापि, हम और दूसरों को भी आधा Karnovsky के निर्धारण सफलतापूर्वक SEM के लिए इस्तेमाल किया है ।
हम भी SEM के लिए भ्रूण सुखाने के दो तरीकों की तुलना में है और एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर या HMDS के रूप में चरण 1 में वर्णित का उपयोग करके नमूने की गुणवत्ता में कोई अंतर नहीं पाया और14कहीं और सूचना दी ।
चरण 2 के लिए, हम परीक्षण 1% कम पिघलने agarose में अंतिम धुलाई चरणों के बाद भ्रूण embedding एक ३५ mm ग्लास पर घुड़सवार-नीचे पकवान और फिर यह के साथ टॉपिंग ~ 10 µ बढ़ते माध्यम के एल । यह एंबेडिंग विधि काम करती है और भ्रूण और संबद्ध संरचनाओं के मूल 3d संरचना को बरकरार रखता है; हालांकि, एक multiphoton माइक्रोस्कोप छवि के लिए आवश्यक नमूना है क्योंकि एक नियमित रूप से फोकल माइक्रोस्कोप बरकरार भ्रूण (~ 1 मिमी) में गहरी के रूप में नहीं पहुंच सकता ।
हम मानते है कि इन दो तकनीकों का प्रयोग सामांय विकास के दौरान और म्यूटेंट में जो इन संरचनाओं के गठन में दोष दिखाने के दौरान नोड और notochordal प्लेट की संरचना पर पूरक जानकारी देता है ।
The authors have nothing to disclose.
H.B. चिकित्सा संकाय और कोलोन विश्वविद्यालय के SFB829 से स्टार्टअप फंडिंग द्वारा समर्थित है । C.X. DFG अनुदान बीए 5810/1-1 द्वारा समर्थित है । हम CECAD अनुसंधान केंद्र और मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर सेंटर (ंयूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका) में इमेजिंग सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम Joaquín Grego-Bessa (हृदय अनुसंधान के लिए स्पेनिश राष्ट्रीय केंद्र, मैड्रिड, स्पेन) WMIF के लिए भ्रूण बढ़ते पर अपनी अंतर्दृष्टि के लिए धंयवाद ।
1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |