Rilevamento e isolamento di corpi apoptotici di elevata purezza

Apoptosi, una forma ben studiata di morte cellulare programmata, sono necessaria per mantenere l’omeostasi fisiologica e rimuovere le cellule potenzialmente dannose all’interno del corpo umano¹. Dopo l’induzione dell’apoptosi, cellule apoptotiche (ApoCells) possono subire una serie di cambiamenti morfologici e smontare in piccole vescicole di membrana-limita, chiamate ApoBDs. Nel complesso, questo processo è noto come smontaggio delle cellule apoptotiche e può essere diviso in 3 fasi distinte sulla base di morfologia^2,3. Passaggio 1 (membrana plasmatica blebbing) è caratterizzata dalla formazione di aerostato-come le strutture sulla superficie delle cellule, noto come vescichette^4,5. Passaggio 2 (formazione di protrusione apoptotici) comprende la formazione di protrusioni di membrana lungo come apoptopodia, apoptopodia in rilievo e microtubuli picchi^6,7,8. Infine, passo 3 (formazione di ApoBD) include la frammentazione apoptotica protrusioni e/o ApoCells per generare ApoBDs^6,9. I risultati precedenti hanno suggerito un ruolo di ApoBDs in favoreggiamento liquidazione delle cellule apoptotiche e mediare la comunicazione intercellulare. Ad esempio, si propone che la frammentazione di un ApoCell in ApoBDs può generare piccoli pezzi ‘bite-sized’ che potrebbero essere facilmente rimossi da circostante fagociti^2,10,11. Inoltre, ApoBDs può harbor una serie di biomolecole quali DNA, RNA e proteine, che possono essere vittime di tratta a cellule circostanti per facilitare cella comunicazione^12,13,14. Per funzionalmente studiare questi processi, è fondamentale per confermare tre parametri chiave, tra cui (i) validazione di induzione di apoptosi e ApoBD formazione, (ii) isolamento di ApoBDs e (iii) la conferma dell’ApoBD purezza.

In precedenza, una serie di metodi tra cui citofluorimetria e microscopia elettronica è stata usata per studiare l’apoptosi e ApoBDs^15,16,17,18. Tuttavia, quantificazione e rilevamento di ApoBD sono spesso difficili o trascurato. Per esempio, l’apoptosi di base di citometria a flusso più ordinariamente utilizzati test impiega Annessina V (A5, una proteina che lega l’esternalizzati ‘ mangiare-me’ segnale fosfatidilserina (PtdSer)) e dell’acido nucleico macchia propidio ioduro (PI)¹⁹. Tuttavia, con questa combinazione di macchia universale, analisi presuppone che ci sono solo tre tipi di sottoinsiemi di cellule (cellule vitali, ApoCells e cellule necrotiche) nel campione. Inoltre, anche se considerata come “gold standard” da molti ricercatori per apoptosi, analisi di citometria a flusso e l’analisi successiva dei dati spesso esclude ApoBDs attraverso un passaggio di gating iniziale selezionando eventi^{intermedio-alto} FSC/SSC. Di conseguenza, abbiamo recentemente sviluppato un’analisi di citometria a flusso romanzo usando A5 e TO-PRO-3, un’altra macchia di acido nucleico che può essere preso in modo selettivo di caspase 3/7-attivato Pannexina 1 (PANX1) canali^7,20. Come attivazione di caspase 3-induced PANX1 precede l’esposizione PtdSer nella fase iniziale dell’apoptosi, TO-PRO-3 macchie differenzialmente apoptotici e cellule necrotiche. Inoltre, questo approccio combinato con il nostro romanzo gating strategia include eventi tutti acquisiti durante l’analisi dei dati e di conseguenza, sei sottoinsiemi di cellule/particella sono identificati, tra cui: (i) cellule vitali (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^basso , A-PRO-3^bassa), (ii) A5^– primi ApoCells (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^basso, TO-PRO-3^intermedi), (iii) A5⁺ ApoCells (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^alta , A-PRO-3^intermedi), cellule necrotiche (iv) o tardo ApoCells (FSC/SSC^{intermedio/alto}, A5^alta, TO-PRO-3^alta), (v) ApoBDs (FSC/SSC^basso, A5^intermedi, a-PRO-3^{basso / intermedio}) e (vi) detriti (FSC/SSC^basso, A5^basso, TO-PRO-3^basso)²⁰. Il nostro approccio sottolinea l’importanza di analizzare tutti i sottoinsiemi di cellule/particella e, cosa ancora più importante, la separazione di ApoBDs dalle cellule e detriti²⁰. Quindi, questo approccio dimostra una tecnica efficace per convalidare l’induzione di apoptosi e ApoBD formazione simultaneamente.

Tradizionalmente, i ApoBDs sono stati isolati attraverso una varietà di approcci di centrifugazione differenziale per cui ApoBDs può essere separato dalle cellule o altre vescicole extracellulari in base alla densità. Tuttavia, tali metodi di centrifugazione sono spesso limitati dalla bassa ApoBD purezza, mancanza di una fase di quantificazione per confermare la purezza del campione e/o incapacità di separare cella tipo-specific ApoBDs^17,21,22. Di conseguenza, abbiamo sviluppato recentemente due approcci, basati su FACS e un nuovo approccio differenziale basato su centrifugazione che può essere accoppiato con il nostro metodo di citometria a flusso precedentemente stabilito per convalidare l’induzione di apoptosi e campione purezza²³. ApoBD isolamento tramite nostro approccio basato su FACS può arricchire ApoBDs fino a 99% di purezza e può essere accoppiato con una varietà di anticorpi specifici del tipo delle cellule per isolare ApoBDs da popolazioni di cellule miste, campioni di tessuti e fluidi corporei²³. Inoltre, il nostro approccio riveduto centrifugazione differenziale viene illustrato un metodo efficiente per isolare ApoBDs a > 90% purezza²³.

In questo articolo, descriviamo dettagliatamente la nostra procedura sperimentale per convalidare l’induzione di apoptosi e per rilevare e quantificare ApoBD formazione. I flussi di lavoro di isolamento ApoBD utilizzando metodi basati su centrifugazione differenziali e basati su FACS anche elaborati e confrontati. I dati rappresentativi dimostrano che la metodologia descritta fornisce un efficace strumento all’avanguardia per gli studi futuri di ApoBD.