זיהוי ובידוד של מוות לגופים טוהר גבוהה
Summary
זרימת עבודה באמצעות צנטריפוגה לזרום cytometry או דיפרנציאלית מפותחת לזהות, לבודד את הגופות אפופטוטיים להיפגע מן דוגמה אפופטוטיים להיפגע טוהר גבוהה לכמת.
Abstract
מוות גופים (ApoBDs), שלפוחיות זעירות exosomes הם אנשי מפתח של משפחת שלפוחית חוץ-תאית, עם ApoBDs של הסוג הגדול. זה הוצע כי ApoBDs יכול לסייע תא סיווג, כמו גם המערכת בתקשורת דרך מולקולות לסחר בבני אדם. גישות קונבנציונליות, המשמש את זיהוי ובידוד של ApoBDs מוגבלים לעיתים קרובות על ידי העדר כימות מדויק וטוהר מדגם נמוך. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה כדי לאשר את תנאי הגיוס של אפופטוזיס, לאמת ApoBD היווצרות לבודד ApoBDs על טוהר גבוהה. אנו גם חלוקה לרמות, להשוות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) וגישות צנטריפוגה דיפרנציאלי המבוסס על מנת לבודד ApoBDs. יתר על כן, טוהר ApoBDs מבודדים תאושר באמצעות בעבר להקים לזרום cytometry מבוססי מכתים ושיטת אנליטית. יחדיו, באמצעות הגישה המתוארת, THP-1 מונוציט אפופטוזיס ועל מוות תא פירוק היה המושרה ואומתו, והיו ApoBD המופקים THP-1 ומונוציטים מבודד טוהר של 97-99%.
Introduction
אפופטוזיס, צורה למד היטב של מוות תאים מתוכנת, נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגית וכדי להסיר תאים מזיקים בתוך גוף האדם1. לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס, מוות תאי (ApoCells) ניתן לעבור סדרה של שינויים מורפולוגיים, לפרק לתוך שלפוחית ממברנה מכורך קטן הנקרא ApoBDs. באופן כללי, תהליך זה מכונה פירוק התא אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות מחולק 3 שלבים נפרדים בהתבסס על מורפולוגיה2,3. שלב 1 (קרום פלזמה blebbing) מאופיין על ידי היווצרות של מבנים דמויי בלון על פני תאים המכונה מגדלים פורחים4,5. שלב 2 (אפופטוטיים להיפגע תיתכן היווצרות) כולל להיווצרות בליטות ממברנה ארוך כמו apoptopodia, apoptopodia עם חרוזים, microtubule קוצים6,7,8. לבסוף, בשלב 3 (היווצרות ApoBD) כוללת את הפיצול בליטות מוות ו/או ApoCells כדי ליצור6,ApoBDs9. ממצאים קודמים הציעו תפקיד של ApoBDs ב מוות תא סיווג וסיוע תיווכה תקשורת המערכת. כך למשל, מוצע כי חלוקת ApoCell לתוך ApoBDs עשוי לייצר קטן ” הסוף יכול להסירו בקלות על-ידי תחימת phagocytes2,10,11. יתר על כן, ייתכן ApoBDs הארבור סדרה של מולקולות כמו DNA, RNA וחלבונים, אשר עשוי להיות הנסחר את התאים המקיפים אותם כדי להקל על התא-תא תקשורת12,13,14. לחקור באופן פונקציונלי תהליכים אלה, זה חיוני כדי לאשר שלושה פרמטרים מרכזיים כולל (i) אימות של אפופטוזיס ויצירת ApoBD, (ii) בידוד של ApoBDs, וכן (iii) אישור של טוהר ApoBD.
בעבר, היו בשימוש מספר שיטות כולל cytometry זרימה ואלקטרון ללמוד ואפופטוזיס ו ApoBDs15,16,17,18. עם זאת, ApoBD זיהוי, כימות הם לעתים קרובות קשה או תסולא בפז. למשל, ביותר-בשימוש שגרתי לזרום cytometry מבוססי אפופטוזיס assay מעסיקה annexin V (A5, חלבון זה מאגד את המוחצנים ‘ לאכול-לי ‘ האות phosphatidylserine (PtdSer)) חומצת גרעין כתם propidium יודיד (PI)19. עם זאת, באמצעות שילוב הכתם אוניברסלי, ניתוח מבוסס על ההנחה כי יש רק שלושה סוגים של תאים קבוצות משנה (התאים קיימא, ApoCells ותאי נמק) במדגם. יתר על כן, למרות נחשב “תקן הזהב” על ידי חוקרים רבים עבור אפופטוזיס, מבחני cytometry זרימה, ניתוח הנתונים הבאים לעיתים קרובות אינו כולל ApoBDs דרך צעד המגביל ראשוני בחירת אירועיםבינוני-גבוהה FSC/האס. לכן, פיתחנו לאחרונה וזמינותו cytometry זרימה הרומן באמצעות A5 ואל-PRO-3, עוד כתם nucleic יכול להיות סלקטיבי נלקח על ידי קספאז 3/7-הופעלו pannexin 1 (PANX1) ערוצי7,20. כפי קספאז 3-induced PANX1 ההפעלה לפני חשיפה PtdSer בשלב מוקדם של אפופטוזיס, אל-PRO-3 כתמים באופן שונה אפופטוטיים להיפגע ותאים נמק. בנוסף, גישה זו בשילוב עם הרומן שלנו gating אסטרטגיה כוללת אירועים הכל רכשה במהלך ניתוח נתונים, כתוצאה מכך, שישה תאים/חלקיקים תת-ערכות מזוהים, לרבות: (i) התאים קיימא (FSC/האסבינוני/גבוה, A5נמוך , אל-PRO-3נמוך), (ii) A5– ApoCells מוקדם (FSC/האסבינוני/גבוה, A5נמוכה, אל-PRO-3ביניים), (iii) A5+ ApoCells (FSC/האסבינוני/גבוה, A5גבוהה , אל-PRO-3ביניים), תאים עם נמק (iv) או מאוחר ApoCells (FSC/האסבינוני/גבוה, A5גבוה, אל-PRO-3גבוהה) (v) ApoBDs (FSC/האסנמוך, A5ביניים, אל-PRO-3נמוך / ביניים), ו (vi) פסולת (FSC/האסנמוך, A5נמוכה, אל-PRO-3נמוכה)20. הגישה שלנו מדגישה את החשיבות של ניתוח כל התאים/חלקיקים קבוצות משנה ו, וחשוב, ההפרדה של ApoBDs מן התאים פסולת20. לפיכך, גישה זו מדגימה טכניקה יעילה כדי לאמת את אינדוקציה של אפופטוזיס ויצירת ApoBD בו זמנית.
באופן מסורתי, ApoBDs היו מבודדים באמצעות מגוון רחב של גישות צנטריפוגה דיפרנציאלי לפיו ניתן להפריד ApoBDs תאים או אחרים שלפוחית חוץ-תאית בהתבסס על צפיפות. עם זאת, שיטות כאלה צנטריפוגה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי נמוך ApoBD טוהר, חוסר צעד כימות לאשר מדגם טוהר, ו/או חוסר היכולת להפריד בין תאים ייחודיים לסוג ApoBDs17,21,22. לכן, לאחרונה פיתחנו שתי הגישות, מבוסס-FACS, דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גישה חדשה אשר יכול להיות בשילוב עם שיטת cytometry זרימה שנקבעו קודם שלנו כדי לאמת את אינדוקציה של טוהר אפופטוזיס ודגימת23. ApoBD בידוד באמצעות הגישה שלנו מבוססת-FACS יכול להעשיר ApoBDs של עד 99% טוהר, יכול להיות בשילוב עם מגוון רחב של נוגדנים ייחודיים לסוג התא כדי לבודד ApoBDs אוכלוסיות מעורבות לתאים, דגימות רקמה, נוזלי גוף23. יתר על כן, הגישה שלנו צנטריפוגה דיפרנציאלית המתוקן מדגימה שיטה יעילה כדי לבודד ApoBDs כדי > 90% טוהר23.
בנייר זה, נתאר בפירוט שלנו הליך ניסיוני לאימות אפופטוזיס, וכדי לזהות ולכמת היווצרות ApoBD. ApoBD בידוד של זרימות העבודה בשיטות FACS ומבוססי -דיפרנציאלי המבוסס על צנטריפוגה גם פירט, בהשוואה. הנתונים נציג מדגימים כי המתודולוגיה המתוארת מספק כלי יעיל חדשנית ללימודי ApoBD בעתיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאז התיאור שלו בתחילת שנות החמישים, השדה של אפופטוזיס התקדם במידה ניכרת, להפוך אזור מחקרים בולטים. למרות האינטרס הרחב המאמצים, היבטים מסוימים של אפופטוזיס, בפרט היווצרות של ApoBDs, לא טוב נחקרו בשל היעדר מתודולוגיות המתאים. אלה כוללים בעיקר המגבלה תוך מעקב אחר התקדמות אפופטוזיס, היווצרות ApoBD ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נארגן את זה נתמך על ידי מענקים הלאומי לבריאות ואת המועצה למחקר רפואי (GNT1125033 ו- GNT1140187) מועצת המחקר האוסטרלי (DP170103790) I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
