كشف وعزل الهيئات أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية
Summary
يتم وضع سير عمل باستخدام الطرد المركزي التدفق الخلوي أو التفاضلية لاكتشاف وتحديد وعزل الهيئات أبوبتوتيك من نموذج أبوبتوتيك بدرجة نقاء عالية.
Abstract
الهيئات أبوبتوتيك (أبوبدس)، ميكروفيسيكليس، واكسوسوميس من الأعضاء الرئيسيين في الأسرة حويصلة خارج الخلية، مع كونها واحدة من نوع أكبر أبوبدس. واقترح أن أبوبدس يمكن أن تساعد في إزالة الخلايا، فضلا عن الاتصالات بين الخلايا من خلال الاتجار بالجزيئات الحيوية. النهج التقليدية المستخدمة لتحديد وعزل أبوبدس هي غالباً ما تكون محدودة بسبب عدم دقة القياس الكمي ونقاء العينة منخفضا. هنا، يمكننا وصف سير عمل تأكيد تنظيم دورات تعريفية للمبرمج، والتحقق من صحة تكوين عببد، وعزل أبوبدس بدرجة نقاء عالية. وسنعمل أيضا الخطوط العريضة ومقارنة الأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) والطرد المركزي التفاضلي على أساس نهج لعزل أبوبدس. وعلاوة على ذلك، سيتم تأكيد نقاء أبوبدس معزولة باستخدام سبق إنشاء التدفق الخلوي على تلطيخ والأسلوب التحليلي. مجتمعة، باستخدام النهج المبين، الناجم عن تفكيك الخلية المبرمج و apoptotic الوحيدات THP-1 والتحقق من صحتها، وعببد المتولدة من وحيدات THP-1 كانت معزولة لدرجة نقاء من 97-99%.
Introduction
المبرمج، نموذج مدروسة من موت الخلايا المبرمج، مطلوب للمحافظة على التوازن الفسيولوجي وإزالة الخلايا الضارة داخل جسم الإنسان1. بعد إدخال المبرمج، خلايا أبوبتوتيك (أبوسيلس) يمكن إجراء سلسلة من التغييرات الشكلية وتفكيكه إلى حويصلات غشاء زمنياً صغيرة تسمى أبوبدس. عموما، هذه العملية هي المعروفة بتفكيك خلية أبوبتوتيك ويمكن تقسيمها إلى 3 خطوات متميزة استناداً إلى مورفولوجيا2،3. الخطوة 1 (غشاء البلازما بلبينغ) يتسم بتشكيل هياكل تشبه البالون على سطح الخلية المعروفة باسم بليبس4،5. الخطوة 2 (apoptotic تشكيل نتوء) يتضمن تشكيل نتوءات غشاء طويلة مثل أبوبتوبوديا، أبوبتوبوديا بالخرز و microtubule المسامير6،،من78. وأخيراً، يتضمن الخطوة 3 (تشكيل عببد) تجزؤ نتوءات أبوبتوتيك و/أو أبوسيلس لتوليد أبوبدس6،9. وقد اقترح النتائج السابقة دور أبوبدس في مساعدة إزالة خلية أبوبتوتيك والتوسط للاتصالات بين الخلايا. على سبيل المثال، يقترح أن تجزئة أبوسيل إلى أبوبدس قد يولد القطع الصغيرة ‘لدغة الحجم’ التي يمكن إزالتها بسهولة عن طريق إحاطة البالعات2،10،11. وعلاوة على ذلك، قد تأوي أبوبدس سلسلة من الجزيئات الحيوية مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، والتي قد تكون بهن إلى الخلايا المجاورة لتيسير خلية خلية الاتصالات12،،من1314. وظيفيا التحقيق في هذه العمليات، من المهم للتأكد من المعلمات الرئيسية الثلاث بما في ذلك (ط) التحقق من صحة الاستقراء المبرمج وتشكيل عببد، (ثانيا) عزل أبوبدس، و (ثالثا) تأكيد نقاء عببد.
سابقا، قد استخدمت عدد من الأساليب بما في ذلك التدفق الخلوي والمجهر الإلكتروني لدراسة الخلايا وأبوبدس15،16،،من1718. ومع ذلك، عببد الكشف والتحديد الكمي غالباً ما تكون صعبة أو تجاهلها. على سبيل المثال، الاعتداء المبرمج على أساس قياس التدفق الأكثر استخداماً بشكل روتيني توظف annexin الخامس (A5، بروتين الذي يربط الخارجية ‘أكل-لي’ إشارة فوسفاتيديلسيريني (بتدسير)) والحمض النووي (PI) يوديد propidium19وصمة عار. ومع ذلك، باستخدام هذا المزيج العالمي وصمة عار، يفترض التحليل أن هناك ثلاثة أنواع فقط من مجموعات فرعية خلية (خلايا قابلة للحياة وأبوسيلس ونخريه الخلايا) في العينة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من اعتبار “معيار الذهبي” بالعديد من الباحثين للمبرمج، التدفق الخلوي فحوصات وتحليل البيانات اللاحقة غالباً ما يستبعد أبوبدس من خلال خطوة أولية النابضة تحديد أحداث منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة-عالية . ولذلك، قمنا مؤخرا بتطوير فحص الخلوي تدفق رواية استخدام A5 والي-برو-3، وصمة عار النووية الأخرى التي يمكن اتخاذها بصورة انتقائية طريق caspase 3/7-تنشيط بانيكسين 1 (PANX1) القنوات7،20. كما caspase الناجمين عن 3 PANX1 التنشيط يسبق التعرض بتدسير في مرحلة مبكرة من المبرمج، إلى-برو-3 خلطات بقع نخرية الخلايا وأبوبتوتيك. وبالإضافة إلى ذلك، يشمل هذا النهج جنبا إلى جنب مع الرواية لدينا النابضة استراتيجية المكتسبة جميع الأحداث أثناء تحليل البيانات، ونتيجة لذلك حددت ست مجموعات فرعية خلية/الجسيمات، بما في ذلك: (ط) خلايا قابلة للحياة (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5 منخفض ، 3–إلى–برومنخفضة)، (ثانيا) A5– أبوسيلس المبكر (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5منخفضة، إلى-برو-3المتوسطة)، (ثالثا) A5+ أبوسيلس (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5عالية ، إلى-برو-3المتوسطة)، (رابعا) نخرية الخلايا أو أبوسيلس الراحل (منتدى التعاون الأمني/SSCمتوسطة/عالية، A5عالية، إلى-برو-3عالية)، (v) أبوبدس (منتدى التعاون الأمني/SSCمنخفضة، A5الوسيطة، إلى-برو-3منخفض /الوسيطة)، و (سادسا) الحطام (منتدى التعاون الأمني/SSCمنخفضة، A5منخفضة، إلى-برو-3منخفض)20. نهجنا تشدد على أهمية تحليل جميع خلايا/الجسيمات مجموعات فرعية، والأهم من ذلك، فصل أبوبدس عن الخلايا والحطام20. وهكذا، يوضح هذا النهج أسلوب فعال للتحقق من صحة الاستقراء المبرمج وتشكيل عببد في وقت واحد.
تقليديا، كانت معزولة عن طريق مجموعة متنوعة من النهج التفاضلي الطرد المركزي حيث يمكن فصل أبوبدس من الخلايا أو حويصلات خارج الخلية الأخرى على أساس كثافة أبوبدس. ومع ذلك، تقتصر أساليب الطرد المركزي هذه غالباً ما منخفض عببد النقاء، عدم وجود خطوة التحديد الكمي لتأكيد نقاوة العينة، و/أو عدم القدرة على فصل الخلية المحددة بنوع أبوبدس17،،من2122. ولذلك وضعنا مؤخرا نهجين والقائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية ونهج المستندة إلى استخدام الطرد المركزي تفاضلية جديدة التي يمكن أن تقترن باسلوبنا الخلوي التدفق المحددة سابقا للتحقق من صحة الاستقراء من المبرمج وعينه نقاء23. عببد العزلة عبر نهجنا القائم على نظام مراقبة الأصول الميدانية يمكن أن تثري أبوبدس ما يصل إلى 99 ٪ النقاء، ويمكن أن يقترن بمجموعة متنوعة من الأجسام المضادة لنوع معين خلية لعزل أبوبدس من الخلايا المختلطة السكان، وعينات الأنسجة وسوائل الجسم23. وعلاوة على ذلك، يوضح نهجنا الطرد المركزي التفاضلي المنقحة طريقة فعالة لعزل أبوبدس إلى > نقاء 90%23.
في هذه الورقة، ويصف لنا بالتفصيل لدينا إجراءات تجريبية للتحقق من صحة الاستقراء المبرمج، وكشف وتحديد تشكيل عببد. كما وضعت العزلة عببد مهام سير العمل باستخدام الأساليب القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية والتفاضلية المستندة إلى استخدام الطرد المركزي ومقارنة. وتظهر البيانات الممثلة أن المنهجية وصف يوفر أداة فعالة متطورة للدراسات المستقبلية عببد.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ أوائل الوصف الخاص به في الخمسينات، تقدمت ميدان المبرمج ملحوظا، أصبحت منطقة بارزة لبحث. ورغم الاهتمام الواسع والجهود المكثفة، جوانب معينة من المبرمج، وبخاصة تشكيل أبوبدس، لم جيدا تدرس نظراً لعدم وجود منهجيات ملائمة. تشمل هذه لا سيما الحد في تتبع التقدم المبرمج وتشكيل عببد في وقت واحد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وهذا عمل تدعمها المنح التي تقدمها الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (GNT1125033 و GNT1140187) والمجلس الأسترالي للبحوث (DP170103790) إلى I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
