Cuantificar distancias intermembrana con dilataciones de imagen Serial

Métodos estadísticos: Se hicieron comparaciones entre grupos experimentales del estudiante t-pruebas. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo y todos los valores se representan como media ± desviación estándar. Segmentación manual. La cuantificación de la anchura de nanodomain de perinexus GJ adyacentes (conp) normalmente se logra por segmentación manual. Este proceso de segmentación manual se demuestra en la figura 1A y fue descrito previamente6. El observador identifica el borde de la GJ (figura 1, punto rojo), mide 5nm en el centro de la perinexus y mide la distancia entre las membranas en ese momento. El proceso entonces se repite en 10, 15, 30 y cada 15 nm hasta 150 nm. Esta técnica, al mismo tiempo eficaz, tiene limitaciones de tiempo y muestreo espacial menores a lo largo de la longitud de la perinexus. Significa que las mediciones dep W de los estudios anteriores pueden variar de aproximadamente 10 a 20 nm2,3,10y 3 nm parece ser la diferencia de medias es necesaria para detectar la significación estadística, que es muy por encima de la frecuencia de Nyquist espacial de 0,7 nm por medición basado en una resolución interpixel de 0.34 nm. Por lo tanto, mientras que la segmentación manual es lento, el método es suficiente para medir diferencias en Wp asociada a un estado de enfermedad o intervención. Dilataciones imagen serial. Para medir la perinexus de una manera más rápida y reproducible con resolución espacial adecuada, hemos desarrollado un programa basado en las dilataciones imagen serial para contar los píxeles entre dos membranas remontado manualmente, que pueden verse en la figura 1B . El proceso de dilatación serie se ilustra en la figura 4. Como se dilata la imagen binaria (Figura 4A-4D), que dilatación es luego invertida y añadida a una imagen de trabajo – la forma no-binaria del contorno original (figura 4E-4 H). El proceso se repite hasta que el contorno se rellena completamente (figura 4D). En este punto, la imagen final del trabajo (figura 4H) es un recuento del número de veces que un píxel particular ha permanecido sin dilatación. Como tal, los valores de cerca el contorno de las membranas celulares son muy bajos, mientras que los valores en el centro son más altos. Al contar el número de dilataciones para rellenar el área en cada punto, se puede calcular la distancia entre los bordes de la membrana. El próximo desafío es identificar y aislar a la línea central para cuantificar anchura perinexal en función de la distancia de GJ, que se realiza aplicando primero un derivado espacial a la imagen final del trabajo (figura 2-imagen pasada y figura 5 A). Un segundo ejemplo de un perinexus de forma irregular se puede encontrar en archivo suplementario S3. Identificación de la línea central. El gradiente de la imagen final del trabajo se puede cuantificar por un derivado espacial, como cuenta de dilatación valores de borde a borde cambian de alta a baja a alto otra vez (figura 5A de izquierda a derecha). Considerando sólo la magnitud de la derivada espacial (figura 5B), el contorno y la línea central, con flechas blancas, son inmediatamente identificables como áreas de discontinuidad. En estos lugares, la dirección del degradado cambia de creciente a decreciente o viceversa. Aplicación de un umbral (figura 5C) produce una imagen binaria de la línea central y el contorno, y restando el contorno original rinde la línea central aislada(figura 5). Mientras que este método de aislamiento de la línea central es computacionalmente eficiente, el umbral aplicado a la derivada espacial crea huecos en la línea central resultante. Llenar estos vacíos (figura 5D, insertar) para proporcionar una medida exacta de la distancia de la GJ y para que la perinexus se mide en su totalidad. En primer lugar, la línea central se dilata para rellenar los huecos (figura 5E), seguidos por una erosión (figura 5F) y una función de “bwmorph” (operación = ‘skel’, n = inf) para eliminar la mayor cantidad de puntos posible dejando un línea central continua, aumentando la eficiencia computacional de un algoritmo pathfinding posteriores desarrollado por Wasit Limprasert y disponible en MATLAB Central9. Esta función de dilatación la erosión produce la completa línea de central, que se combina con la imagen del trabajo final (figura 5G). Sin embargo, esta línea central es a menudo más de un píxel de grosor y por lo tanto no es un aislamiento preciso de la línea central. El algoritmo pathfinding de Wasit Limprasert se utiliza para determinar la línea central de perinexus. El algoritmo pathfinding es capaz de rastrear los valores más altos – en este caso los valores más cercanos al centro que seguía siendo no-dilatado a través de más iteraciones a lo largo de la línea central (figura 5G, coloque). El resultado es un seguimiento automático de la línea central, como se muestra en la figura 6. Aislando la línea central, ancho de perinexal puede presentarse como una función de la distancia desde el extremo de la GJ, como se muestra en la figura 6B (arriba), o como el ancho promedio de una región determinada de interés. Análisis de núcleo. Es importante tener en cuenta que imágenes convertidas a digital se basan en arreglos de discos de Plaza y núcleos de dilatación se basan además en matrices cuadradas. Esto significa que la distancia de dilatación a través de una diagonal es mayor que ortogonales. Por lo tanto, a continuación intentamos determinar si el núcleo afectado los resultados del algoritmo. Para cuantificar la variabilidad específica de núcleo, se analizaron cinco formas diferentes kernel: “Plus” (la forma utilizada en los análisis anteriores), “X”, “caja” y “línea”, como se describe en la figura 7A. El núcleo se aplica en cada punto cero de una imagen binaria. La estrella en cada núcleo de la figura 7A representa el centro, donde es un valor de 1 blanco y negro es un valor de 0 para el núcleo de la dilatación. Influencia de cada núcleo en la medida dep W media de una sola imagen perinexal aproximadamente horizontal (figura 7B, arriba), cuantificadas por un usuario experimentado, se determinó girar la imagen con el comando “imrotate” de Matlab y Computación conp en pasos de 10 °. Los valores de medición Wp (figura 7B, fondo) fluctúan con la orientación de la imagen de una manera sinusoidal rectificada con un Plus en forma de núcleo. Los valores más bajos ocurren cuando un perinexus relativamente recta está orientado vertical u horizontalmente. Granos el X, caja, ni línea proporcionan alguna ventaja sobre el núcleo en forma de plus. Los kernels de X y la caja producción resultados idénticos, pero los valores de significan Wp fueran fuera de fase con the núcleo Plus por 45 °. El núcleo de la línea ha podido dilatar completamente la imagen en ciertos ángulos como se aprecia por la ausencia de datos en el rastro verde de imágenes giradas a menos de 30 o más de 145 °. Así, el núcleo de dilatación más ortogonal sobrestimó la separación de membrana cuando dilatando un perinexus con un eje orientado diagonalmente por ejemplo a aproximadamente 45 °, y los granos X y caja subestimaron media Wp cuando el eje largo de la perinexus estaba también en 45°. Basándonos en este análisis, hemos creado un factor de corrección que se aplica a los valores generados a partir de dilatación con el núcleo en forma de plus. Para tener en cuenta la sobrestimación de la separación de membrana asociada a la orientación de la imagen, este factor de corrección multiplicado por el valor de anchura medidos según la orientación de la imagen (ecuación 1). Si θ < 45°      Wp corregido = cosd(θ) * Wp medido Si θ ≥ 45 °      Wp corregido = cosd(θ) * Wp medido (ecuación 1) En esta ecuación, Wp medido es el valor original dep W generado por el algoritmo anterior y θ es el ángulo calculado de horizontal, en grados. Θ se calcula tomando la tangente inversa del cambio total en la dirección horizontal dividida por el cambio total en la dirección vertical de la línea central de perinexal. La corrección anterior aproxima el ángulo promedio, con respecto a la horizontal, de la perinexus (figura 8A, izquierda-arriba) y los resultados en una medida como si de un perinexus horizontal (figura 8A, esquina inferior izquierda). La lógica detrás de esta ecuación viene del hecho de que el núcleo en forma de plus (figura 7A) es esencialmente dos en forma de línea de núcleos dispuestos ortogonalmente entre sí. Así, por debajo de 45° (más cercano a la horizontal), las dilataciones se producen verticalmente y por lo tanto multiplicando por el coseno del ángulo da la medida correcta. Por el contrario, para los ángulos por encima de las dilataciones (más cercanos a la vertical), 45° se producen horizontalmente y el seno se utiliza para determinar la medida correcta. A exactamente 45°, el seno y el coseno son iguales. Archivo suplementario S4 proporciona una representación de este concepto. Tenga en cuenta que esta corrección se basa en el ángulo medio y debe tener precaución al analizar formas sustancialmente lineal. Este proceso se repitió en 20 perinexi seleccionadas al azar y las medidas corregidas fuertemente correlacionaron con las mediciones obtenidas por rotación manualmente y volver a analizar las imágenes (figura 8A, derecho). Para confirmar la corrección exacta para la orientación de la imagen, dos conjuntos de bordes fantasmas fueron generados (figura 8B, izquierda) y girar 180 °. Con la corrección de funciones trigonométrica, el algoritmo devuelve exactamente el valor correcto en cada orientación, independientemente de la resolución espacial o tamaño de la imagen (figura 8B, derecha). Aplicación analítica y reproducibilidad con corrección de orientación. Recordando que estudios previos usando segmentación manual informe estadísticamente significativo quiere decir diferencias dep W mayores que o igualan a 3 nm, era importante determinar si el algoritmo se podría utilizar para recapitular los resultados anteriores con un conjunto de datos completo. Mediante el algoritmo nuevo, dos observadores – una experiencia y una inexperta con análisis perinexal (OBS. 1 y 2 OBS., respectivamente)-analizaron las mismas imágenes de un estudio anterior6 que incluyó 12 pacientes que fueron diagnosticados con la fibrilación auricular (FA) antes de la colección de tejidos y 29 pacientes que no tiene AF preexistente (No-AF). El usuario experimentado encontró que conp fue significativamente mayor en pacientes con FA que sin FA (21.9±2.5 y 18.4±2.0 nm, respectivamente, figura 9A). Estos valores con el factor de corrección aplicado son similares a ésos divulgados previamente (24.4±2.2 nm y 20.7±2.4 nm, respectivamente)6. Lo importante es que, un usuario inexperto encontró la misma diferencia significativa (22.1±2.8 nm y 20.1±2.6 nm, respectivamente) entre los Estados de la enfermedad con el programa automatizado. Además, la desviación estándar de los valores dep W no cambió con el factor de corrección, que indica que la desviación estándar de 2-3 nm no es un artefacto del algoritmo pero de la estructura sí mismo y el proceso de tejido. Estos resultados demuestran que el método automatizado propuesto es capaz de recapitular los resultados de estudios anteriores. Importante, la perinexus es una estructura recientemente definidos y no hay consenso sobre el rango de los valores absolutos de la separación de la membrana adyacente a la GJ2,3. Desde ancho GJ-membrana-a-externo-membrana externa se ha estimado previamente en 20 nm13, se procuró determinar la eficacia del algoritmo midiendo también anchura GJ. Ambos observadores no encontrados diferencias significativas entre anchos de ensambladura de gap (GJW) de los pacientes con o sin FA preexistente (figura 9B). Valores absolutos de GJW de AF y AF no pacientes fueron 20.5 ± 2,5 nm y 20,3 ± 1.9 nm, respectivamente, para el observador experimentado y 21.0 ± 3.1 nm y 20,0 ± 2.2 nm para el observador inexperto, similar a lo que se ha divulgado previamente. Para determinar si el algoritmo automatizado requiere menos tiempo para analizar los datos de la segmentación manual, tanto los usuarios experimentados y sin experiencia registran el tiempo necesario cuantificar una formación de imagen de 10 set (archivo suplementario S5). Tabla 1 demuestra que los usuario experimentado y sin experiencia disminuyó el tiempo de análisis por 4.7 – y 8.3 veces respectivamente, utilizando el algoritmo automatizado en relación con el enfoque de la segmentación manual, con un aumento de aproximadamente 43-fold espacial resolución a lo largo de la perinexus. Algoritmo de resolución de problemas. El error más común cuando se ejecuta el algoritmo ocurre cuando la línea central final no termina en el borde de la imagen. En tales casos, no hay suficientes puntos se seleccionaron el mapa derivado espacial, haciendo que el programa falle y producir un mensaje de error asesorando al usuario para seleccionar un área de cultivo más grande o aumentar el umbral derivado espacial. Dibujo una caja más grande de cultivo mejorará la confiabilidad del programa en algunos casos como los cambios espaciales derivados drásticamente cerca de los bordes de la figura, que puede interrumpir los algoritmos de detección de pathfinding o borde. También es posible para el algoritmo pathfinding a no identificar correctamente la línea central, incluso si la línea central alcanza el borde de la imagen, particularmente si el gradiente es muy baja (figura 2A). Si el umbral de gradiente se establece demasiado alto, habrá más puntos innecesario incorporadas el algoritmo pathfinding (figura 2B), disminución de eficiencia computacional. Si el usuario es incapaz de determinar un umbral adecuado, la matriz de la imagen “GMag” (figura 2C), que es generado por el programa y puede encontrarse en el espacio de trabajo, ayuda al usuario determinar el umbral. Encontrar los puntos a lo largo de la línea central y establecer el umbral ligeramente por encima de su valor de índice para asegurar que estos puntos se seleccionan. En el ejemplo, un umbral adecuado sería encima de ~5.1 (figura 2C, insertar). El punto de inicio también puede no llegar al inicio de la perinexus (figura 2D). En este caso, vuelva a ejecutar el programa y establezca el valor de Arranque Manual en 1. Después de la línea central se ha aislado, el usuario selecciona un punto fuera de la perinexus y el punto de la línea central más cercano al píxel seleccionado (figura 2E, cuadrado rojo) se establecerá como el punto de inicio. El resultado es la línea central completa (figura 2F). Figura 1 : Imágenes TEM con los procesos de cuantificación. El proceso de segmentación manual (A) requiere que el usuario realizar mediciones intermembrane individuales 12 mientras que la estimación de la línea central. El proceso automático (B) requiere un seguimiento manual, continuo del contorno de la perinexus. El punto rojo en cada imagen representa el extremo usuario identificado de la GJ y el comienzo de la perinexus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.  Figura 2 : Solución de problemas de línea central. Dos modos principales de falla para la identificación de la línea central y sus soluciones: cada imagen se etiqueta con el nombre de matriz en Matlab. Si el gradiente umbral es demasiado bajo (A, umbral de 0,2) puede fallar el algoritmo de la línea central. Ajuste el umbral demasiado alto (B, umbral 70) puede reducir la eficiencia computacional del algoritmo pathfinding. Puede determinarse un umbral de gradiente adecuado de la matriz de GMag (C, insertar). Si la línea central no puede alcanzar el borde del comienzo de la perinexus (D), el usuario puede optar por seleccionar manualmente el punto de inicio. Después el “Start Point” opción se establece en 1 en el GUI de la apertura, el usuario, luego selecciona un punto fuera de la perinexus de interés (E). El resultado final debe ser una línea central que representa con precisión la totalidad de la perinexus (F). Todas las etiquetas en las citas (A-F) corresponden a los nombres de variables en Matlab. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Selección de Perinexus. Para recortar el perinexus, haga clic en y mantener para arrastrar un cuadro alrededor de ella (la herramienta Recortar está seleccionada automáticamente) como se muestra por la flecha azul. Este cuadro puede ajustarse mediante el uso de las plazas en las esquinas y lados para hacerla más grande o más pequeño. La flecha verde representa el final de la perinexus, que el usuario debe asegurarse se mantiene “abierto”. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Dilataciones de imagen serial. El esquema binario repetidamente es dilatado en incrementos de un píxel (A-d) y añadido a la imagen de trabajo (la forma no-binaria de la imagen, E-H) después de cada dilatación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: pathfinding y aislamiento de la línea central. Un derivado espacial se calcula a partir de la imagen final del trabajo (A) y la magnitud de ese derivado espacial (B) se utiliza para aislar el contorno y la línea central (flechas blancas). Un umbral definido por el usuario identifica el contorno y la línea central y restando el contorno original rinde la línea central (D). Sin embargo, las brechas aparecen en la línea central como resultado del umbral (D – insertar). Para producir una línea central continua, una dilatación secundaria se realiza en la línea central aislada (E), seguida por una erosión secundaria para aumentar la eficiencia computacional de un algoritmo pathfinding posterior. Esta imagen erosionada (F) se combina con la imagen final del trabajo, lo que permite la identificación de una línea central continua, un pixel de grosor (G – insertar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6 : Presentación de datos final. El programa de salidas el contorno final encima de la imagen original de TEM (A). La línea es de color verde para 0-150 nm, azul para la región definida por el usuario de interés y el rojo para la zona más allá de 150 nm. Además, el programa de salidas de un gráfico similar color representando conp como una función de la distancia desde el inicio de la perinexus y para la región de interés (B), así como el promedio de Wp (recuadro gráfico respectivo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7 : Análisis de forma de dilatación núcleo. Formas para núcleos de dilatación (A): la estrella en el centro representa los píxeles dilatados. Cajas blancas son píxeles afectados por la dilatación, en forma de un plus, X, cuadro o línea. Un perinexus aproximadamente horizontal (superior, con una línea roja que indica 0° B) se gira hacia la derecha de 0 a 180° en pasos de 10° y varias ocasiones dilatada usando las formas kernel diferentes (B, fondo). Núcleos en forma de Plus y línea producen resultados similares, aunque el núcleo de la línea falla en ciertas orientaciones, mientras que los núcleos en forma de caja y X son fuera de fase de 45 °. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8 : Corrección de orientación de la imagen. A correcta para la orientación de la imagen, el ángulo medio de la perinexus se calcula de las posiciones de la salida – y final puntos (A, izquierda, principio y fin de línea negra). La tangente inversa del cambio en la dirección y (A, línea izquierda, verde) había dividido por el cambio en el rendimiento de la dirección de x (A, izquierda, línea roja) el ángulo de corrección, θ (A, a la izquierda, amarillo). El objetivo es corregir entonces el valor promedio dep W para dar la distancia mínima entre los bordes, como si la perinexus había sido fotografiada aproximadamente horizontalmente (una, abajo a la izquierda). La aplicación del factor corrección descrita por la ecuación 1 se comparó con rotación manualmente cada una de las 15 imágenes seleccionadas al azar por el θ calculado antes del análisis. Los valores corregidos fuertemente correlacionaron con los valores de la imagen rotada (R2 = 0.991, A, derecha), que indica la ecuación 1 es un factor de corrección válida para orientación de la imagen. Para confirmar que el factor de corrección es adecuado, se generaron dos fantasmas de bordes perfectamente paralela con una distancia conocida entre ellos (B, a la izquierda). Fantasma 1 y 2 de fantasma tienen resoluciones espaciales de 2,833 pixeles / mm y 71,6 píxeles/pulgada, respectivamente. Como se muestra por los diamantes azules y cuadrados rojos en B, a la derecha, el algoritmo exactamente calcula sus anchos en 180 grados de rotación de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9 : Reproducibilidad de algoritmo. Con el proceso automático de corrección de orientación de la imagen, un observador experimentado e inexperto diferencias significativas entre AF y AF No grupos (A), consistentes con un estudio previo, detectar una diferencia mínima de 2.6 nm. Además, ni observador encontró una diferencia significativa en GJW (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Manual Automático Tiempo – OBS. 1 (s) 205±11 44±14 Tiempo – OBS 2 (s) 248±18 30±5 Resolución espacial (mediciones/nm) 0.08 3.45 Tabla 1: comparación de los procesos manuales y automáticos de. Ambos observadores requieren menos tiempo por imagen para trazar el contorno de to realizar el proceso de segmentación manual para un sistema de formación de la imagen 10. Además, el proceso automático tiene una mayor frecuencia de muestreo, registrando 3,45 mediciones por nm, en comparación con un promedio de 1 medida cada 12.5 nm para el proceso manual. El entrenamiento conjunto imágenes en suplementario S5 de archivo, junto con esquemas y medidas como realizada por un usuario experimentado.