Quantificar intermembranar distâncias com dilatações imagem Serial

Métodos estatísticos: Foram feitas comparações entre os grupos experimentais usando testes t de Student. Um p-valor < 0,05 é considerado significativo e todos os valores são representados como média ± desvio-padrão. Segmentação manual. A quantificação da GJ-adjacente perinexus nanodomain largura (W.p) normalmente é realizada pela segmentação manual. Este processo de segmentação manual é demonstrado na Figura 1A e foi descrito anteriormente6. O observador identifica a borda da GJ (Figura 1, ponto vermelho), mede 5nm ao longo do centro do perinexus e mede a distância entre as membranas nesse ponto. O processo então é repetido em 10, 15, 30 e cada 15 nm até 150 nm. Esta técnica, ao mesmo tempo eficaz, tem limitações de tempo e espacial sob amostragem ao longo do comprimento da perinexus. Quer dizer Wp medidas de estudos anteriores podem variar de aproximadamente 10 a 20 nm2,3,10e 3 nm parece ser a diferença média necessária para detectar a significância estatística, que é bem acima da frequência de Nyquist espacial de 0,7 nm por medição com base em uma resolução de interpixel de 0,34 nm. Portanto, enquanto segmentação manual é demorada, o método é suficiente para medir as diferenças de Wp associado a um estado de doença ou intervenção. Imagem serial dilatações. Para medir a perinexus de forma mais rápida, podem ser reproduzida com resolução espacial adequada, desenvolvemos um programa baseado em dilatações imagem serial para contar os pixels entre duas membranas tracejamento de manualmente, o que podem ser vistos na Figura 1B . O processo de dilatação serial é ilustrado na Figura 4. Como a imagem binária é dilatada (Figura 4A-4D), que a dilatação é então invertida e adicionada a uma imagem de trabalho – a forma não-binários do contorno original (Figura 4E-4 H). O processo é repetido até que o contorno é inteiramente preenchido (Figura 4-D). Neste ponto, a imagem final de trabalho (Figura 4-H) é uma contagem do número de vezes que um determinado pixel manteve-se un-dilatado. Como tal, os valores perto o contorno das membranas celulares são muito baixos, enquanto os valores no centro são mais altos. Contando o número de dilatações para preencher a área em cada ponto, a distância entre as bordas da membrana pode ser calculada. O próximo desafio é identificar e isolar a linha central de forma a quantificar a largura de perinexal em função da distância entre o GJ, que é feito aplicando primeiro um derivado espacial para a imagem final de trabalho (Figura 2-última imagem e Figura 5 A). Um segundo exemplo de uma perinexus mais irregulares pode ser encontrado no arquivo suplementar S3. Identificação de linha de centro. O gradiente da imagem trabalho final pode ser quantificado por um derivado espacial, como contagem de dilatação valores de borda a borda alteram de alta para baixa a alta novamente (Figura 5A esquerda para a direita). Considerando apenas a magnitude da derivada espacial (Figura 5B), o contorno e a linha de centro, destacada com setas brancas, são imediatamente identificáveis como áreas de descontinuidade. Nesses locais, a direção do gradiente muda de crescente para decrescente, ou vice-versa. Aplicar um limite (Figura 5C) produz uma imagem binária da linha central e contorno, e subtrair o contorno original produz a linha central isolado (Figura 5-D). Enquanto este método de isolar a linha central é computacionalmente eficiente, o limiar aplicado para a derivada espacial cria lacunas na linha central resultante. Estas lacunas (inserirFigura 5D,) devem ser preenchidas para fornecer uma medição precisa da distância a partir da GJ e para garantir que o perinexus é medido em sua totalidade. Primeiro, a linha central está dilatada para preencher quaisquer lacunas (Figura 5E), seguidas de uma erosão (Figura 5-F) e uma função de “bwmorph” (operação = ‘skel’, n = inf) para eliminar o máximo de pontos possível, deixando um linha contínua central, aumentando assim a eficiência computacional de um algoritmo de pathfinding subsequentes desenvolvido por Wasit Limprasert e disponível no MATLAB Central9. Esta função de dilatação-erosão produz a linha central concluída, que é combinada com a imagem do trabalho final (Figura 5G). No entanto, esta linha central é muitas vezes mais do que um pixel de espesso e, portanto, não é um isolamento preciso da linha de centro. O algoritmo de pathfinding Wasit Limprasert é usado para determinar a linha de centro de perinexus. O algoritmo de pathfinding é capaz de controlar os valores mais altos – neste caso os valores mais próximos ao centro que permaneceu un-dilatado por mais iterações ao longo da linha central (Figura 5G, inserir). O resultado é um rastreamento automático da linha de centro, conforme mostrado na Figura 6. Ao isolar a linha central, perinexal largura pode ser apresentada como uma função da distância entre a extremidade do GJ, como mostrado na Figura 6B (superior), ou como a largura média de uma região especificada de interesse. Análise de kernel. É importante notar que imagens digitalizadas são baseadas em matrizes quadradas e miolo de dilatação baseiam-se igualmente a matrizes quadradas. Isto significa que a distância de dilatação, uma diagonal é maior que ortogonais. Portanto, procuramos seguir determinar se o kernel afetou os resultados do algoritmo. A fim de quantificar a variabilidade do kernel específico, foram analisadas cinco formas de kernel diferente: “Plus” (a forma usada nas análises acima), “X”, “caixa” e “linha”, conforme descrito na Figura 7A. O kernel é aplicado em cada ponto de não-zero de uma imagem binária. A estrela em cada núcleo da Figura 7A representa o centro, onde é um valor de 1 branco e preto é um valor de 0 para o kernel de dilatação. Influência do cada kernel na medição médiap W de uma única imagem de perinexal aproximadamente horizontal (Figura 7B, top), quantificada por um usuário experiente, determinou-se por rodar a imagem com o comando de “imrotate” do Matlab e computação Wp em passos de 10 °. Os valores de medição dep W (Figura 7B, inferior) flutuarem com a orientação da imagem de forma senoidal retificada com um Plus em forma do kernel. Os menores valores ocorrem quando um perinexus relativamente reto é orientado verticalmente ou horizontalmente. O X, caixa, nem linha miolo fornecido qualquer vantagem sobre o kernel em forma de adição. Os kernels X e caixa produziram resultados idênticos, mas os valores de significam Wp estavam fora de fase com the kernel Plus por 45 °. O kernel de linha não conseguiu dilatar totalmente a imagem em certos ângulos, como pode ser visto pela ausência de dados no rastreamento de verde para imagens giradas a menos de 30 ou mais de 145 °. Assim, o kernel de dilatação ortogonal Plus superestimou a separação de membrana quando dilatar um perinexus com um eixo orientado na diagonal por exemplo a aproximadamente 45 °, e os kernels X e caixa subestimaram significa Wp quando o eixo longitudinal do perinexus foi também a 45°. Com base nesta análise, desenvolvemos um fator de correção aplicado aos valores gerados a partir de dilatação com o kernel em forma de adição. A conta para a superestimação da separação de membrana associada com a orientação da imagem, esse fator de correção, multiplicado pelo valor medido largura dependendo da orientação da imagem (equação 1). Se θ < 45°      Wp corrigido = cosd(θ) * Wp medido Se θ ≥45 °      Wp corrigido = cosd(θ) * Wp medido (equação 1) Nesta equação, Wp medido é o valor dep W original gerado pelo algoritmo acima e θ é o ângulo calculado da horizontal, em graus. Θ é calculado tomando-se a tangente inversa da mudança total na direção horizontal, dividida pela mudança total na direção vertical da linha central do perinexal. A correção acima se aproxima o ângulo médio, em relação à horizontal, da perinexus (Figura 8A, esquerda-superior) e resulta em uma medida de como se obtidos de um perinexus horizontal (Figura 8A, esquerda-inferior). A lógica por trás desta equação vem do fato de que o kernel em forma de plus (Figura 7A) é essencialmente dois em forma de linha núcleos dispostos ortogonalmente uns aos outros. Como tal, abaixo de 45° (mais perto de horizontal), as dilatações ocorrem verticalmente e, portanto, multiplicando o cosseno do ângulo dá a medida correta. Por outro lado, para ângulos acima (mais perto de vertical), dilatações de 45° ocorrem na horizontal e o seno é usado para determinar a medida correta. Precisamente a 45 °, o seno e cosseno são iguais. Arquivo suplementar S4 fornece uma representação deste conceito. Observe que essa correção se baseia o ângulo médio e cautela deve ser usada quando analisando formas substancialmente não-linear. Este processo foi repetido em 20 perinexi selecionados aleatoriamente e as medições corrigidas fortemente correlacionaram com medidas obtidas manualmente girando e re-analisando as imagens (Figura 8A, direito). Para confirmar a correção exata para a orientação da imagem, dois conjuntos de bordas fantasmas foram gerados (Figura 8B, à esquerda) e girada 180 °. Com a correção trigonométrica, o algoritmo retornado com precisão o valor correto em cada orientação, independentemente da resolução espacial ou tamanho da imagem (Figura 8B, direita). Aplicação analítica e reprodutibilidade com orientação correção. Recordando que estudos anteriores usando segmentação manual relatório estatisticamente significante significa diferenças dep W maiores que ou igual a 3 nm, foi importante para determinar se ao algoritmo poderia ser usado para recapitular as conclusões anteriores usando um conjunto de dados completo. Usando o novo algoritmo, dois observadores – experientes e inexperientes com análise de perinexal (Obs. 1 e 2 de Obs, respectivamente)-analisaram as mesmas imagens de um estudo anterior6 , que incluiu 12 pacientes que foram diagnosticados com atrial Fibrilação (AF) antes da coleta de tecido e 29 pacientes que não tinham AF pre-existente (não-AF). O usuário experiente descobriu que o Wp era significativamente maior em pacientes com AF do que sem AF (21.9±2.5 e 18.4±2.0 nm, respectivamente, Figura 9A). Esses valores com o fator de correção aplicado são similares para aqueles relatados anteriormente (24.4±2.2 nm e 20.7±2.4 nm, respectivamente)6. Importante, o usuário inexperiente encontrou a mesma diferença significativa (22.1±2.8 nm e 20.1±2.6 nm, respectivamente) entre os Estados de doença com o programa automatizado. Além disso, o desvio-padrão dos valores dep W não mudou com o fator de correção, indicando que o desvio padrão de 2-3 nm não é um artefato do algoritmo, mas da estrutura em si e o processamento do tecido. Estes resultados demonstram que o método automatizado proposto é capaz de sintetizando os resultados de estudos anteriores. Importante, a perinexus é uma estrutura definida recentemente e não tem um consenso sobre a gama de valores absolutos da separação de membrana adjacente ao GJ2,3. Desde que a largura GJ-membrana-para-exterior-membrana externa foi anteriormente estimada em 20 nm13, procuramos determinar a eficácia do algoritmo medindo também largura GJ. Ambos os observadores não encontrados nenhuma diferença significativa entre as larguras de junção de gap (GJW) de pacientes com ou sem AF pré-existentes (Figura 9B). Valores GJW absolutos para AF e AF não pacientes eram 20,5 ± 2,5 nm e 20,3 ± 1,9 nm, respectivamente, para o observador experiente e 21,0 nm ± 3,1 e 20,0 ± 2,2 nm para o observador inexperiente, semelhante ao que foi relatado anteriormente. Para determinar se o algoritmo automatizado necessário menos tempo para analisar os dados de segmentação manual, tanto o usuário experiente e inexperiente gravou o tempo necessários para quantificar um 10-imagem de treinamento conjunto (arquivo suplementar S5). A tabela 1 demonstra que o usuário experiente e inexperiente diminuiu o tempo de análise por 4.7 – e 8.3 vezes respectivamente, usando o algoritmo automatizado em relação a abordagem de segmentação manual, com aproximadamente 43-fold aumento espacial resolução ao longo do perinexus. Algoritmo de solução de problemas. O erro mais comum quando a execução do algoritmo ocorre quando a linha central do final não termina na borda da imagem. Em tais casos, não bastante pontos foram selecionados do mapa derivado espacial, fazendo com que o programa falhar e produzir uma mensagem de erro avisando o usuário para selecionar uma área maior de colheita ou aumentar o limiar de derivativos espacial. Desenho de uma caixa de colheita a maior irá melhorar a confiabilidade do programa em alguns casos, como as alterações espaciais derivadas drasticamente perto das bordas da figura, que pode interromper os pathfinding ou borda algoritmos de detecção. Também é possível para o algoritmo de pathfinding a falhar identificar correctamente a linha central, mesmo que a linha central atinge a borda da imagem, particularmente se o limite de gradiente é muito baixo(Figura 2). Se o limite de gradiente é definido muito alto, haverá mais pontos desnecessários incorporados o algoritmo de pathfinding (Figura 2B), diminuindo a eficiência computacional. Se o usuário é capaz de determinar um limite adequado, a matriz de imagem “GMag” (Figura 2C), que é gerado pelo programa e pode ser encontrado na área de trabalho, pode ajudar o usuário determinar o limiar. Encontrar pontos ao longo da linha central e definir o limite ligeiramente acima de seu valor de índice para garantir que estes pontos são selecionados. No exemplo dado, um limite adequado seria superior a ~5.1 (Figura 2C, inserir). O ponto de partida também pode falhar ao atingir o início da perinexus (Figura 2D). Nesse caso, execute novamente o programa e definir o valor do Manual Start para 1. Depois que a linha central tem sido isolada, o usuário seleciona um ponto fora o perinexus e o ponto da linha central mais próximo do pixel selecionado (Figura 2,E, Praça vermelha) será definido como o ponto de partida. O resultado é a completa linha central (Figura 2-F). Figura 1 : Imagens de temperatura com processos de quantificação. O processo de segmentação manual (A) requer que o usuário executar 12 medições intermembranar individuais enquanto Estimando a linha de centro. O processo automático (B) requer um traço manual, contínuo do contorno do perinexus. O ponto vermelho em cada imagem representa o final do GJ-usuário identificado e o início da perinexus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.  Figura 2 : Solução de linha de centro. Dois modos principais de falha para a identificação da linha central e suas soluções: cada imagem é rotulada com o nome de matriz em Matlab. Se o limite de gradiente é muito baixa (A, o limite de 0,2), o algoritmo de linha central pode falhar. Configurando o limite muito alto (B, limite 70) pode reduzir a eficiência computacional do algoritmo de pathfinding. Um limite de gradiente apropriado pode ser determinado da matriz GMag (C, inserir). Se a central não consegue chegar ao fim do começo da perinexus (D), o usuário pode optar por seleccionar manualmente o ponto de partida. Após o “Iniciar aponte” opção é definida como 1 na abertura GUI, o usuário então seleciona um ponto fora do perinexus de interesse (E). O resultado final deve ser uma linha de centro que retrata com precisão a totalidade da perinexus (F). Todos os rótulos em citações (A-F) correspondem os nomes de variáveis em Matlab. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Seleção de Perinexus. A cultura do perinexus, clique e segure para arrastar uma caixa em torno dela (a ferramenta Corte Demarcado estiver selecionada automaticamente), como indicado pela seta azul. Esta caixa pode ser ajustada usando-se os quadrados sobre os lados e cantos para torná-lo maior ou menor. O Arqueiro Verde representa o fim do perinexus, que o usuário deve assegurar que permanece “aberto”. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Dilatações imagem serial. O contorno binário é repetidamente dilatado em incrementos de um pixel (A-D) e adicionado à imagem do trabalho (forma não-binários da imagem, E-H) após cada dilatação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: pathfinding e isolamento da linha central. Um derivado espacial é calculado a partir da imagem final de trabalho (A) e a magnitude do que derivado espacial (B) é usada para isolar o contorno e a linha central (setas brancas). Um limite definido pelo usuário identifica o contorno e linha de centro e subtraindo o contorno original produz a linha de centro (D). No entanto, as lacunas aparecem na linha central como resultado o limiar (D – inserir). A fim de produzir uma linha contínua, uma dilatação secundária é realizada na linha central isolado (E), seguido por uma erosão secundária para aumentar a eficiência computacional de um algoritmo de pathfinding subsequentes. Esta imagem erodida (F) é então combinada com a imagem final do trabalho, permitindo a identificação de uma contínua, um pixel-espessura da linha central (G – inserir). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Apresentação de dados final. O programa gera o contorno final em cima da imagem original de temperatura (A). A linha é codificados por cores verde para 0-150 nm, azul para a região definida pelo usuário de interesse e vermelho para a área além de 150 nm. Além disso, o programa gera um gráfico Color-coded da mesma forma que representa Wp em função da distância desde o início da perinexus e para a região de interesse (B), bem como a média de Wp (baixo-relevo no respectivo gráfico). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7 : Análise de forma dilatação do kernel. Formas para kernels de dilatação (A): a estrela no meio representa os pixels dilatados. Caixas brancas são pixels afectadas a dilatação, na forma de um plus, X, caixa ou linha. Um perinexus de aproximadamente horizontal (B, top, com uma linha vermelha indicando 0°) foi girado no sentido horário de 0 a 180° em passos de 10° e repetidamente dilatada usando as formas diferentes do kernel (B, inferior). Plus e linha-em forma de sementes produzem resultados semelhantes, embora o kernel linha falha em determinadas orientações, enquanto os núcleos em forma de caixa – e X estão fora de fase em 45 °. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8 : Orientação de correção de imagem. Para correta para a orientação da imagem, o ângulo médio do perinexus é calculado a partir das posições do início – e end – points (A, deixada, início e fim de linha preta). A tangente inversa da mudança na direção y (uma, linha verde, à esquerda) dividida pela mudança em rendimentos a direção x (uma, linha vermelha, à esquerda) o ângulo de correção, θ (, à esquerda, amarela). O objetivo é então, corrigir o valor médio dep W para dar a distância mínima entre as bordas, como se o perinexus tivesse sido fotografada aproximadamente horizontalmente (abaixo, esquerda). A aplicação do factor de correcção descrita pela equação 1 foi comparada com manualmente cada um dos 15 selecionados aleatoriamente imagens rotativas pelo θ calculado antes da análise. Os valores corrigidos fortemente correlacionaram com os valores da imagem girada (R2 = 0.991, A, direita), indicando a equação 1 é um factor de correcção válido para orientação da imagem. Para confirmar que o fator de correção é apropriado, dois fantasmas foram geradas das bordas perfeitamente paralelo com uma distância conhecida entre eles (B, esquerda). Fantasma 1 e 2 de Phantom possuem resoluções espaciais de 2,833 pixels / mm. e 71,6 pixels/pol., respectivamente. Conforme mostrado pelos diamantes azuis e quadrados vermelhos em B, bem, o algoritmo com precisão calcula suas larguras em 180 graus de rotação de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9 : Reprodutibilidade algoritmo. Usando o processo automático com correção de orientação da imagem, o observador experiente e inexperiente encontrado diferenças significativas entre AF e AF não grupos (A), consistentes com um estudo anterior, detectando uma diferença mínima de 2,6 nm. Além disso, nenhum observador encontrou uma diferença significativa em GJW (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Manual Automático Tempo – Obs 1 (s) 205±11 44±14 Tempo – Obs 2 (s) 248±18 30±5 Resolução espacial (medições/nm) 0.08 3.45 Tabela 1: comparação de processos manuais e automáticos. Ambos os observadores necessário menos tempo por imagem para traçar o contorno do que to executar o processo de segmentação manual para um conjunto de treinamento 10-imagem. Além disso, o processo automático tem uma maior frequência de amostragem, gravação 3,45 medições por nm, em comparação com uma média de 1 medida cada 12.5 nm para o processo manual. As imagens de treinamento conjunto encontram-se em suplementar arquivo S5, juntamente com contornos e medições como realizado por um usuário experiente.