シリアル イメージの肥大と膜間距離を定量化

統計的手法:スチューデント t-検定を用いた実験群間比較を行った。P 値 < 0.05 は重要と見なされ、すべての値は、平均 ± 標準偏差として表されます。 マニュアルでのセグメンテーション。GJ 隣接 perinexus ナノドメイン幅 (Wp) の定量化は、マニュアルでのセグメンテーションによって行われます通常。このマニュアルでのセグメンテーションのプロセス図 1Aで例示されていて6で説明しました。オブザーバー GJ (図 1、赤ドット) のエッジを識別、perinexus の中心に沿って 5 nm を測定し、その時点で膜間距離を測定します。10、15、30、およびすべての 15 で繰り返すし、最大 150 nm nm。この技術は、効果的には、時間と空間のアンダー サンプリング、perinexus の長さに沿っての制限があります。 前の調査からの Wp測定によって異なります約 20 nm2,3、1010 と 3 を意味する nm は、平均値の差は、統計的有意性を検出するために必要と思われる、0.7 のナイキスト周波数測定あたり nm ベース 0.34 の interpixel 解像度 nm。したがって、マニュアルでのセグメンテーションは時間がかかるが、メソッドは介入や病気の状態に関連付けられた Wpの違いを測定するのに十分です。 シリアル画像不整。適切な空間分解能を持つ高速、再現可能な方法で、perinexus を測定するために図 1B で見ることができる 2 つの手動でトレース膜間のピクセル数をカウントするシリアル イメージ膨張に基づくプログラムを開発しました。. シリアル拡張プロセスを図 4に示します。バイナリ イメージの拡張として (図 4 a-4D)、拡張は、反転し、作業イメージ – 元のアウトライン (図 4E-4 H) の非バイナリ フォームに追加します。アウトラインが完全に満ちて (図 4D) になるまで繰り返します。この時点で、最終的な作業イメージ (図 4H) は特定のピクセルが非拡張残っている回数のカウントです。ですから、細胞膜の輪郭に近い値が非常に低く、中心に値が高い。各ポイントで領域を埋めるための肥大の数を数えることによって膜エッジ間の距離を計算できます。次の課題は識別する最終的な作業のイメージを空間微分を適用して行われている GJ からの距離の関数として perinexal 幅を定量化するために中心線を分離する (図 2-最後の画像と図 5 A)。補足ファイル S3 より不規則な形をした perinexus の 2 番目の例を見つけることが。 中心線識別します。最終的な作業イメージのグラデーションは、エッジからエッジまでの値をもう一度 (図 5A左右から) に低高高から変更拡張数と空間微分による定量化できます。空間微分 (図 5B) の大きさのみを考慮した概要と白い矢印で強調表示され、中心線が不連続な部分としてすぐに識別。これらの場所で増加する減少またはその逆からグラデーションの方向を変更します。中心線、輪郭のバイナリ イメージを生成するしきい値 (図 5C) を適用して (図 5D) の分離のセンターラインを生成元のアウトラインを引きます。中心線を分離するこの方法は計算効率のよい、空間微分に適用されるしきい値は結果の中心線のギャップを作成します。GJ からの距離の正確な測定を提供し、perinexus はそのままの状態で測定できるように、これらの隙間 (図 5D、挿入) する必要があります。続いて侵食 (図 5F) と”bwmorph”関数 (図 5E) のギャップを埋めるため、センターラインを拡張する最初に、(操作 = ‘skel’ n inf を =) を残しながら、できるだけ多くのポイントを除去するために、連続センターライン、Wasit Limprasert によって開発され、MATLAB 中央9で入手可能それ以降の経路探索アルゴリズムの計算効率を高めます。この膨張収縮機能は最終的な作業イメージ (図 5G) を組み合わせて完成した線が生成されます。しかし、この中心線は厚いピクセル以上で、多くの場合、中心線の正確な分離はないため。 Wasit Limprasert 経路探索アルゴリズムは、perinexus の中心線を決定するためです。経路探索アルゴリズムは最高値 – この場合は残った (図 5G、挿入) 中心線に沿って最も反復非拡張センターに最も近い値を追跡することです。結果は、図 6に示すように、中心線の自動トレースです。中心線を分離することによって、perinexal 幅は、GJ、図 6B (上) のようにの端からの距離の関数として、または関心の特定の領域の平均の幅として表示できます。 カーネル分析します。デジタル画像は正方形アレイに基づく拡張カーネルは正方行列に同様に基づいていることに注意することが重要です。これは対角線にわたって拡張距離が直交より大きいことを意味します。したがって、我々 は次にカーネルにアルゴリズムの結果が影響を受けるかどうかを決定ましょう。カーネルに固有の変動性を定量化するために 5 つの異なるカーネルの形を分析した:「プラス」(上記の分析で使用される形状)、”X”、”ボックス”で、”行”、図 7で説明したよう。カーネルは、バイナリ イメージの各非ゼロのポイントで適用されます。図 7Aのそれぞれのカーネルの星では、中心、ホワイト 1 の値ですし、黒は拡張カーネルの場合は 0 の値を表します。 各カーネルの影響 (図 7B、トップ) 単一の水平約 perinexal イメージの平均の Wp測定経験豊富なユーザーによって定量化、Matlab の”imrotate”コマンドで画像を回転させることにより決定されたとコンピューティング Wpを 10 ° ステップで。Wp測定値 (図 7B下)に加えてカーネルを形に正弦波整流的イメージの方向で変動します。比較的まっすぐ perinexus は、垂直方向または水平方向に指向の場合は、値の小さい方になります。X、ボックスもラインのカーネルは、十字型カーネル上の任意の利点を提供します。Xとボックスのカーネルと同じ結果、しかしの値意味 Wpされた theの位相ずれに 45 °プラスカーネル。ラインのカーネルは、画像回転未満 30 以上 145 ° の緑のトレース データの欠如で見ることができる特定の角度で画像を完全に拡張に失敗しました。したがって、直交プラス拡張カーネル過大評価膜分離斜め約 45 ° で、例えば指向軸と perinexus を拡張とX ボックスのカーネル過小評価平均 Wp、perinexus の長い軸が 45 ° にもあったとき。この分析に基づいて、プラスの形をしたカーネルと拡張から生成された値に適用される補正係数を開発しました。イメージの方向、イメージ (式 1) の方向に応じて測定幅値で乗算この補正係数に関連付けられている分離膜の過大評価のために。 場合 θ < 45 °      Wp 修正 cosd(θ) = * Wp 測定場合 θ ≥45 °      Wp 修正 cosd(θ) = * Wp 測定(式 1) この方程式 Wp測定は上記のアルゴリズムと θ によって生成された元の Wp値は水平、角度から計算された角度します。Θ は、perinexal 中心線の鉛直方向の変化量で割った値の水平方向の変化量の逆タンジェントを撮影したものです。上記の補正に近い、perinexus の水平を基準にして、平均の角度 (図 8A左上) あたかも水平 perinexus から得られる測定結果と (図 8A左下)。この方程式の背後にある理論的根拠は、十字型カーネル (図 7A) は本質的に 2 つライン状のカーネル互いに直交配置であるという事実から来ています。など、下 45 ° (水平に近い)、肥大が垂直方向に発生して、正確な測定を与えるため角度のコサイン掛けて。逆に、角度 45 ° (垂直に近い)、不整上発生水平方向にし、サインを使用して正確な測定を決定します。正確に 45 ° の正弦と余弦が等しいです。補足ファイル S4 は、この概念の描写を提供します。この補正は角度の平均値に基づいて大幅に非線形図形を解析するときに注意を使用する必要がありますに注意してください。このプロセスは 20 のランダムに選択された perinexi の繰り返された、修正された測定は手動で回転、画像 (図 8A右) の再分析によって得られる測定と強く相関します。画像の向きの正確な補正を確認するには、ファントム エッジの 2 つのセットが生成された (図 8B、左) と 180 ° 回転させる。三角関数の補正アルゴリズムは正確に空間解像度や画像サイズ (図 8B右) に関係なく、それぞれの方向で正しい値を返しました。 分析アプリケーションと再現性方向に修正します。統計的に有意なマニュアルでのセグメンテーションのレポートを使った過去の研究が意味の Wpの違いより大きいまたは 3 に等しい呼び戻す nm、アルゴリズムを可能性がありますを使用して前の調査結果を要約する使用かどうかを判断することが重要だ、完全なデータセットです。2 つのオブザーバー – 新しいアルゴリズムを使用して経験し、perinexal 分析未経験 (観測 1 と観測 2 それぞれ)-12 房と診断された人の患者が含まれて以前の研究6から同じ画像を分析細動 (AF) 組織の採取と既存 AF (AF) を持っていなかった 29 患者の前に。経験豊富なユーザーことがわかった Wpよりも AF AF なし患者のかなり広い (21.9±2.5 および 18.4±2.0 の nm それぞれ、図 9A)。補正係数の適用をこれらの値は以前これらの報告に似ています (24.4±2.2 nm、20.7±2.4 nm、それぞれ)6。重要なは、経験の浅いユーザーは同じ有意差を発見した (22.1±2.8 nm、20.1±2.6 nm、それぞれ) 自動化されたプログラムと病気の状態の間。さらに、Wp値の標準偏差は 2-3 nm の標準偏差がアルゴリズムが構造の人工物を示す補正係数を変更しなかった自体とティッシュの処理。これらの結果は、自動化された手法が先行研究の結果を要約できることを示しています。 重要なは、perinexus は最近定義の構造体を GJ2,3に隣接する膜分離の絶対値の範囲には、コンセンサスを達していません。外側-膜-する-外膜 GJ 幅は、20 nm13以前と推定されている、ので我々 も GJ の幅を測定することによってアルゴリズムの有効性を判断しようとします。両方のオブザーバーは、患者既存 AF (図 9B) の有無の差ギャップ接合幅 (GJW) が見つかりません。AF と非 AF 患者 GJW 絶対値は、経験豊かな観察者と 21.0 ± 3.1 nm と以前報告されているものに似たような経験の浅いオブザーバー 20.0 ± 2.2 nm のそれぞれ 20.5 ± 2.5 nm と 20.3 ± 1.9 nm をあった。 自動アルゴリズムがマニュアルでのセグメンテーションよりデータを分析するより少ない時間を必要かどうかを確認するのに両方および経験の浅いユーザーはタイムを記録 (補足ファイル S5) セット 10 イメージ トレーニングを定量化する必要な。および経験の浅いユーザー減少している解析時間で 4.7 〜 と 8.3 倍それぞれ空間で約 43-fold の増加とマニュアルでのセグメンテーション アプローチに対する自動アルゴリズムを使用して表 1に示します解像度、perinexus に沿って。 アルゴリズムのトラブルシューティングをします。アルゴリズムを実行するときに最も一般的なエラーは、最終的な中心線が画像の端で終了しないときに発生します。このような場合に十分なポイントは失敗し、大きくトリミング領域を選択または空間微分の閾値を上げるユーザー エラー メッセージを生成するプログラムを引き起こしている空間の派生マップから選ばれました。作物は大きいボックスを描画、大幅に経路探索やエッジ検出アルゴリズムを混乱させることができます図の端に近い空間微分変化としていくつかのケースではプログラムの信頼性が向上します。 また、経路探索アルゴリズム (図 2A) 低すぎる特にグラデーションのしきい値がある場合、中心線イメージの端に達した場合でも中心線を正しく識別するために失敗することが可能です。グラデーションのしきい値の設定が高すぎると、計算効率を減少させる経路探索アルゴリズム (図 2B) に組み込まれてより多くの不要なポイントになります。ユーザーは、画像配列の適切なしきい値を決定することができるないかどうか”GMag” (図 2C) プログラムによって生成され、ヘルプ ユーザーしきい値を決定することができます、ワークスペースで見つけることができます。中心線に沿ってポイントを見つけるし、これらの点が選択されていることを確認するには、そのインデックス値をやや上回るしきい値を設定します。特定の例では、適切なしきい値 (図 2C、挿入) ~5.1 上でしょう。 開始点は、perinexus (図 2D) の先頭に到達する失敗することも。この場合、プログラムを再実行、手動起動値を 1 に設定。中心線を分離後、ユーザーは、perinexus 外の点を選択して (図 2E赤の広場) に選択されているピクセルに最も近い中心点を開始点として設定されます。結果は完全中心線 (図 2F) です。 図 1:定量化プロセスの TEM 画像。マニュアルでのセグメンテーションのプロセス (A) には、中心線を推定しながら 12 の個々 の生体計測を実行するユーザーが必要です。(B) の自動のプロセスには、手動、連続、perinexus の概要のトレースが必要です。各画像の赤い点は、GJ のユーザー識別の終わりと、perinexus の始まりを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  図 2: 中心線のトラブルシューティングします。中心線の識別とその解決策の失敗の主に 2 つのモード: 各イメージは Matlab で配列名が付いた。グラデーションのしきい値がすぎる場合は低 (A, 閾値 0.2) センターライン アルゴリズムは失敗することができます。設定しきい値をあまり大きく (B, しきい値 70) は経路探索アルゴリズムの計算効率を減らすことができます。GMag 配列から適切な勾配しきい値を決定ことができます (C を挿入)。中心線は、perinexus (D) の開始エッジに到達する失敗した場合、ユーザーは手動で開始点を選択する選ぶことができます。「開始点」オプションを開く gui のユーザー 1 に設定後、ポイントの外興味 (E) の perinexus を選択します。最終的な結果は、perinexus (F) の全体を正確に表す中心線をする必要があります。引用 (A-F) のすべてのラベルは、Matlab の変数名に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: Perinexus 選択します。Perinexus、青の矢印で示すように、(トリミング ツールが自動的に選択されます) それの周りにボックスをドラッグしてクリックとホールドをトリミングするには。このボックスは、拡大または縮小する辺と四隅に正方形を使用して調整できます。緑の矢印は、「オープン」のままユーザーが確認する必要があります perinexus の端を表すこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: シリアル画像不整。バイナリの概要は繰り返し 1 ピクセルずつ (A-D) に拡張し、後に各作業イメージ (画像 E H の非バイナリ フォーム) に追加。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5:中心線の分離や経路探索。最終的なイメージから空間微分を計算 (A) とその空間微分の大きさ (B) はアウトラインとセンターライン (白い矢印) を分離するために使用します。ユーザー定義のしきい値はアウトラインを示し、中心線し、元のアウトラインを引いてセンターライン (D) が得られます。ただし、しきい値の結果として中心線に欠番 (D – を挿入)。連続中心線を生成するためにセカンダリ拡張はその後経路探索アルゴリズムの計算効率を高めるための二次侵食が続く分離センターライン (E) で実行されます。この侵食されたイメージ (F) は、連続、1 ピクセル厚の中心線の識別を可能にする最終的な作業イメージを組み合わせて (G – を挿入)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: 最終的なデータ プレゼンテーション。プログラムは、元の TEM 画像 (A) の上に最終的な概要を出力します。ラインは 0-150 のため緑色に色分けされて nm、関心と赤 150 を超えた領域のためのユーザー定義領域の青い nm。さらに、プログラムは、平均の Wp (それぞれグラフの挿入)、Wpを表す、perinexus と (B) の関心の領域の始点からの距離の関数として同様に色分けされたグラフを出力します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: 拡張カーネル形状解析します。拡張カーネル (A) の図形: 中央の星は、拡張のピクセルを表します。白い箱は、プラス、X、ボックスまたは線の形での拡張によって影響を受けるピクセルです。約水平 perinexus (B、トップ、0 ° を示す赤い線) は、0 から 180 ° 10 ° と繰り返し拡張 (B、下) の別のカーネル図形を使用して手順を時計回りに回転だった。プラスと線状のカーネルは、ボックスと X 字のカーネルが 45 ° により、特定の方向で行カーネルで失敗するが同様の結果を生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8: 画像の向き補正します。画像の向きを正しい、perinexus の角度の平均値から計算されますの開始- とエンド-points (A、左、黒い線の始点と終点) の位置。Y 方向 (左、緑線、) に変更のアーク タンジェントは補正角度 θ (左、黄色) x 方向 (左、赤い線、) 利回りの変化によって分かれています。目的は、perinexus のおよそ水平方向にイメージを作成されていた場合と同様、エッジ間の最小距離を与える平均 Wp値を修正、(以下、左)。式 1 で説明されている補正係数の適用は、解析の前に計算される θ によって各 15 ランダムに選択した画像を手動で回転する比較しました。回転イメージの値と修正値が相関 (R2 = 0.991、A、右)、イメージの向きに対する有効な補正係数は、式 1 を示します。補正係数が適切なことを確認、2 つの幻は (B, 左) それらの間の既知の距離を完全に並列エッジの生成されました。ファントム 1 とファントム 2 ある 2.833 ピクセルの空間解像度/mm と 71.6 ピクセル/インチ、それぞれ。ブルー ダイヤモンドと B の赤い四角で示すように、右、アルゴリズム正確に計算される、幅 180 ° の画像回転の間で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 9: アルゴリズム再現。自動プロセスを使用すると、画像の向き補正と、両方および経験の浅いオブザーバー発見 AF、ない AF グループ (A) 先行研究と一致して 2.6 の最小差の検出差 nm。さらに、どちらのオブザーバーは、有意差 GJW (B) を発見しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 手動 自動 時間 – 観測 1 (s) 205±11 44±14 時間 – 観測 2 (s) 248±18 30±5 空間分解能 (測定/nm) 0.08 3.45 表 1: 手動および自動プロセスの比較。両方 10 イメージ トレーニング セットの手動分割処理を行うよりもアウトラインをトレースするイメージごとのより少ない時間が必要。さらに、自動プロセスがより高いサンプリング周波数、nm あたり 3.45 測定の記録に比べて 1 測定の平均ごとの 12.5 手動プロセスの nm。トレーニング セット画像は、経験豊富なユーザーによって実行されるように、概要と測定補足ファイル S5 で見つけることが。