Quantificare intermembrana distanze con le dilatazioni immagine seriale

Metodi statistici: I confronti sono stati fatti fra gruppi sperimentali utilizzando il test t di Student. Un valore p < 0,05 è considerato significativo e tutti i valori sono rappresentati come media ± deviazione standard. Segmentazione manuale. La quantificazione della GJ-adiacente perinexus nanodomini larghezza (Wp) avviene in genere mediante segmentazione manuale. Questo processo di segmentazione manuale illustrato in Figura 1A ed è stato descritto in precedenza6. L’osservatore identifica il bordo di GJ (Figura 1, punto rosso), misura 5nm lungo il centro della perinexus e misura la distanza tra le membrane a quel punto. Il processo viene quindi ripetuto alle 10, 15, 30 e ogni 15 nm fino a 150 nm. Questa tecnica, mentre efficace, ha limiti di tempo e di sotto-campionamento spaziale lungo la lunghezza della perinexus. Significa misurep W da studi precedenti possono variare da circa 10 a 20 nm2,3,10e 3 nm sembra essere la differenza media necessaria per rilevare la significatività statistica, che è ben di sopra del frequenza di Nyquist spaziale di 0,7 nm per misura basato su una risoluzione interpixel di 0,34 nm. Pertanto, mentre segmentazione manuale è molto tempo, il metodo è sufficiente per misurare le differenze in Wp associato uno stato di malattia o di intervento. Immagine seriale dilatazioni. Al fine di misurare la perinexus in un modo più veloce, riproducibile con risoluzione spaziale appropriato, abbiamo sviluppato un programma basato sulle dilatazioni immagine seriale per contare i pixel tra due membrane manualmente tracing, che possono essere visto in Figura 1B . Il processo di dilatazione seriale è illustrato nella Figura 4. Come l’immagine binaria è dilatata (Figura 4A-4D), che la dilatazione è quindi invertita e aggiungere un’immagine di lavoro – il modulo non binari del contorno originale (Figura 4E-4h). Il processo viene ripetuto fino a quando il contorno è interamente riempito inD(Figura 4). A questo punto, l’immagine finale di lavoro (Figura 4H) è un conteggio del numero di volte che un determinato pixel è rimasta non dilatato. Come tale, i valori vicino la struttura delle membrane cellulari sono molto bassi, mentre i valori al centro sono più alti. Contando il numero di dilatazioni per riempire l’area in ogni punto, può essere calcolata la distanza tra i bordi della membrana. La prossima sfida è quello di identificare e isolare la linea di mezzeria per quantificare perinexal larghezza in funzione della distanza da GJ, che avviene applicando un derivato spaziale per l’immagine finale di lavoro (Figura 2-Ultima immagine e Figura 5 A). Un secondo esempio di un perinexus più di forma irregolare può essere trovato nel file supplementare S3. Identificazione centerline. La sfumatura dell’immagine lavoro finale può essere quantificata da un derivato spaziale, come conteggio di dilatazione valori da bordo a bordo cambiano da alta a bassa a alta nuovamente (Figura 5A sinistra a destra). Tenendo conto solo della grandezza del derivato spaziale (Figura 5B), il contorno e la linea di mezzeria, evidenziata con frecce bianche, sono immediatamente identificabili come zone di discontinuità. A queste posizioni, la direzione della sfumatura cambia da crescente a decrescente o viceversa. L’applicazione di una soglia (Figura 5C) produce un’immagine binaria della linea di mezzeria e muta, e sottraendo il contorno originale produce la linea di mezzeria isolato(Figura 5). Mentre questo metodo per isolare la linea di mezzeria è computazionalmente efficiente, la soglia applicata alla derivata spaziale crea degli spazi in mezzeria risultante. Queste lacune (Figura 5D, inserire) devono essere compilate per fornire una misurazione accurata della distanza dal GJ e per garantire che perinexus viene misurata nella sua interezza. In primo luogo, la linea di mezzeria è dilatato per colmare eventuali lacune (Figura 5E), seguite da un’erosione (Figura 5F) e una funzione di “bwmorph” (operazione = ‘skel’, n = inf) per eliminare quanti più punti possibile, lasciando un linea d’asse continuo, aumentando così l’efficienza computazionale di un algoritmo di path-finding successive sviluppato da Wasit Limprasert e disponibile su MATLAB Central9. Questa funzione di dilatazione-erosione produce la linea di mezzeria completato, che si combina con l’immagine finale di lavoro (Figura 5G). Tuttavia, questa linea di mezzeria è spesso più di un pixel di spesso e di conseguenza non è un preciso isolamento della linea di mezzeria. L’algoritmo di path-finding Wasit Limprasert viene utilizzato per determinare la linea d’asse perinexus. L’algoritmo di path-finding è in grado di monitorare i valori più alti – in questo caso i valori più vicini al centro che è rimasto non-dilatato più iterazioni lungo la linea centrale (Figura 5G, inserire). Il risultato è un’analisi automatica della linea di mezzeria, come illustrato nella Figura 6. Isolando la linea d’asse, larghezza di perinexal possa essere presentato come una funzione della distanza dall’estremità di GJ, come illustrato nella Figura 6B (in alto), o come la larghezza media di una determinata area di interesse. Analisi kernel. È importante notare che immagini digitalizzate sono basati su matrici quadrate e noccioli di dilatazione similarmente sono basati su matrici quadrate. Questo significa che la distanza di dilatazione attraverso una diagonale è maggiore di ortogonali. Pertanto, abbiamo cercato successiva determinare se il kernel interessati i risultati dell’algoritmo. Al fine di quantificare la variabilità del kernel specifico, sono state analizzate cinque forme di kernel diverso: “Plus” (la forma utilizzata nelle analisi di cui sopra), “X”, “Box” e “linea”, come descritto in Figura 7A. Il kernel è applicato a ogni punto diverso da zero di un’immagine binaria. La stella in ogni kernel di Figura 7A rappresenta il centro, dove bianco è un valore di 1 e un valore pari a 0 per il kernel di dilatazione è nero. Influenza di ogni kernel sulla misurap W media di una singola immagine di perinexal circa orizzontale (Figura 7B, in alto), quantificato da un utente esperto, è stato determinato dalla rotazione dell’immagine con il comando “imrotate” di Matlab e calcolo Wp a passi di 10 °. I valori di misurazione dip W (Figura 7B, in basso) oscillano con orientamento dell’immagine in modo sinusoidale raddrizzato con un Plus a forma di kernel. I valori più bassi si verificano quando un perinexus relativamente diritta è orientato orizzontalmente o verticalmente. La X, casella, né linea kernel fornito alcun vantaggio sopra il nocciolo a forma di più. Il kernel X e casella prodotto risultati identici, ma i valori di dire Wp erano fuori fase con the kernel più di 45 °. Il kernel di linea non è riuscito a dilatare completamente l’immagine in certi angoli, come si evince dall’assenza di dati nella traccia verde per l’immagine ruotata a meno di 30 o più di 145 °. Così, il kernel di dilatazione ortogonale Plus sovrastimato separazione a membrana quando dilatando un perinexus con un asse orientato diagonalmente ad esempio a circa 45 °, e il kernel X e casella sottovalutato significa Wp quando l’asse del perinexus è stato anche a 45°. Sulla base di questa analisi, abbiamo sviluppato un fattore di correzione applicato ai valori generati da dilatare con il kernel a forma di più. Per contabilizzare la sovrastima di separazione a membrana associati con orientamento dell’immagine, questo fattore di correzione moltiplicato per il valore di larghezza misurata a seconda dell’orientamento dell’immagine (equazione 1). Se θ < 45°      Wp rettificato = cosd(θ) * Wp misurata Se θ ≥ 45 °      Wp rettificato = cosd(θ) * Wp misurata (equazione 1) In questa equazione, Wp misurata è il valore dip W originale generato dall’algoritmo sopra e θ è l’angolo calcolato dall’orizzontale, in gradi. Θ è calcolato prendendo la tangente inversa del cambiamento totale nella direzione orizzontale divisa per il totale cambiamento nella direzione verticale della linea di mezzeria perinexal. La correzione precedente si approssima l’angolo medio, relativo orizzontale, della perinexus (Figura 8A, superiore sinistro) e si traduce in una misura come se ottenuti da un perinexus orizzontale (Figura 8A, basso a sinistra). La logica dietro questa equazione deriva dal fatto che il kernel a forma di più (Figura 7A) è essenzialmente due a forma di riga kernel disposti ortogonalmente a vicenda. Come tale, di sotto di 45° (vicino a orizzontale), le dilatazioni verificano verticalmente e quindi moltiplicando per il coseno dell’angolo dà la misura corretta. Al contrario, per gli angoli sopra le dilatazioni (vicino alla verticale), 45° verificarsi orizzontalmente e il seno viene utilizzato per determinare la misura corretta. A 45° con precisione, il seno e coseno sono uguali. File supplementare S4 fornisce una rappresentazione di questo concetto. Si noti che questa correzione è basata sull’angolo medio e deve essere usata cautela quando si analizzano le forme sostanzialmente non-lineare. Questo processo è stato ripetuto il 20 perinexi selezionati in modo casuale e le misurazioni corrette fortemente correlato con misure ottenute manualmente ruotando e ri-analizzando le immagini (Figura 8A, destra). Per confermare la correzione accurata per orientamento dell’immagine, due insiemi dei bordi fantasma sono stati generati (Figura 8B, sinistra) e ruotato di 180 °. Con la correzione trigonometrica, l’algoritmo restituito con precisione il valore corretto a ogni orientamento, risoluzione spaziale indipendentemente dalla dimensione dell’immagine (Figura 8B, destra). Applicazione analitica e riproducibilità con orientamento correzione. Ricordando che gli studi precedenti utilizzando segmentazione manuale rapporto statisticamente significativo dire le differenze dip W maggiore di o uguale a 3 nm, era importante determinare se l’algoritmo potrebbe essere utilizzato per riepilogare i risultati precedenti utilizzando un set di dati completo. Utilizzando il nuovo algoritmo, due osservatori – uno sperimentato e uno unexperienced con analisi perinexal (OBS. 1 e 2 di OBS., rispettivamente)-analizzato le stesse immagini da un precedente studio6 che comprendeva 12 pazienti che sono stati diagnosticati con atriale fibrillazione (AF) prima della raccolta del tessuto e 29 pazienti che non hanno AF pre-esistenti (No-AF). L’utente esperto trovato che Wp era significativamente maggiore nei pazienti con AF rispetto senza AF (21.9±2.5 e 18.4±2.0 nm, rispettivamente, nella figura 9A). Questi valori con il fattore di correzione applicato sono simili a quelli segnalati in precedenza (24.4±2.2 nm e 20.7±2.4 nm, rispettivamente)6. D’importanza, l’utente inesperto trovato la stessa differenza significativa (22.1±2.8 nm e 20.1±2.6 nm, rispettivamente) tra Stati di malattia con il programma automatico. Inoltre, la deviazione standard dei valori dip W non è cambiato con il fattore di correzione, che indica che la deviazione standard di 2-3 nm non è un artefatto dell’algoritmo, ma della struttura stessa e processazione dei tessuti. Questi risultati dimostrano che il metodo proposto automatizzato è capace di ricapitolare i risultati degli studi precedenti. D’importanza, il perinexus è una struttura recentemente definito e nessun consenso è stato raggiunto sulla gamma dei valori assoluti di separazione a membrana adiacente a GJ2,3. Poiché la larghezza GJ-membrana-a-esterno-membrana esterna è stato precedentemente stimato a 20 nm13, abbiamo cercato di determinare l’efficacia dell’algoritmo misurando anche larghezza GJ. Entrambi gli osservatori non trovati alcuna differenza significativa tra larghezze di gap junction (Jan) dei pazienti con o senza pre-esistente AF (Figura 9B). Valori assoluti di Jan per pazienti non-AF e AF erano 20,5 ± 2,5 nm e 20,3 ± 1,9 nm, rispettivamente, per l’osservatore esperto e 21.0 ± 3.1 nm e 20.0 ± 2.2 nm per l’osservatore inesperto, simile a quello che è stato segnalato precedentemente. Per determinare se l’algoritmo automatizzato richiede meno tempo per analizzare i dati di segmentazione manuale, sia l’utente esperto e inesperto hanno registrato il tempo necessario per quantificare una formazione di 10-immagine set (file supplementare S5). Tabella 1 dimostra che l’utente esperto e inesperto in diminuzione tempo di analisi da 4.7 e 8.3 volte rispettivamente utilizzando l’algoritmo automatizzato rispetto all’approccio di segmentazione manuale, con un aumento circa 43-fold spaziale risoluzione lungo il perinexus. Algoritmo di risoluzione dei problemi. L’errore più comune quando si esegue l’algoritmo si verifica quando l’asse di mezzeria finale non si limita al bordo dell’immagine. In tali casi, non abbastanza punti sono stati selezionati dalla mappa derivata spazio, causando il programma per errore e produrre un messaggio di errore consigliare all’utente di selezionare un’area di ritaglio o aumentare la soglia derivata spazio. Disegno di una casella di ritaglio più grande migliorerà l’affidabilità del programma in alcuni casi come le modifiche derivate spaziali drasticamente vicino ai bordi della figura, che possono interferire con gli algoritmi di rilevamento di path-finding o bordo. È anche possibile per l’algoritmo di path-finding a non riescono ad identificare correttamente la linea di mezzeria, anche se la linea di mezzeria raggiunge il bordo dell’immagine, specialmente se la soglia di gradiente è troppo bassa (Figura 2A). Se la soglia di gradiente è impostata troppo alta, non ci sarà più punti inutili inglobati l’algoritmo di path-finding (Figura 2B), diminuendo l’efficienza computazionale. Se l’utente è in grado di determinare una soglia appropriata, la matrice dell’immagine “GMag” (Figura 2C), che viene generato dal programma e può essere trovato nell’area di lavoro, può aiutare l’utente determinare la soglia. Trovare punti lungo la linea centrale e impostare la soglia leggermente sopra il valore di indice per assicurare che questi punti vengono selezionati. Nell’esempio dato, una soglia appropriata sarebbe sopra ~5.1 (Figura 2C, inserire). Il punto di partenza anche potrebbe non riuscire a raggiungere l’inizio della perinexus (Figura 2D). In questo caso, eseguire nuovamente il programma e impostare il valore di Avvio manuale su 1. Dopo la linea d’asse è stata isolata, l’utente seleziona un punto esterno il perinexus e il punto di linea d’asse più vicino al pixel selezionati (Figura 2E, Piazza rossa) verrà impostato come punto di partenza. Il risultato è la linea di mezzeria completo (Figura 2F). Figura 1 : Immagini TEM con processi di quantificazione. Il processo di segmentazione manuale (A) richiede all’utente di eseguire 12 singole misurazioni intermembrana mentre stima la linea di mezzeria. Il processo automatico (B) richiede una traccia manuale, continua del contorno della perinexus. Il puntino rosso in ogni immagine rappresenta fine utente identificato il GJ e l’inizio del perinexus. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.  Figura 2 : Risoluzione dei problemi di linea di mezzeria. Due modalità principali di errore per l’identificazione di linea d’asse e le loro soluzioni: ogni immagine è etichettato con il nome della matrice in Matlab. Se la soglia di gradiente è troppo basso (A, soglia 0,2) l’algoritmo di linea d’asse può avere esito negativo. Impostazione della soglia troppo alta (B, soglia 70) può ridurre l’efficienza computazionale dell’algoritmo path-finding. Un’appropriata soglia gradiente può essere determinata dalla matrice GMag (C, inserire). Se la linea di mezzeria non riesce a raggiungere il bordo di inizio della perinexus (D), l’utente può optare per selezionare manualmente il punto iniziale. Dopo la “Start Point” opzione è impostata su 1 nella GUI di apertura, l’utente, quindi seleziona un punto di fuori del perinexus di interesse (E). Il risultato finale dovrebbe essere una linea di mezzeria che descrive accuratamente la totalità del perinexus (F). Tutte le etichette in citazioni (A-F) corrispondono ai nomi di variabile in Matlab. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Selezione di Perinexus. Per ritagliare il perinexus, click-and-hold per trascinare una casella intorno a esso (lo strumento Ritaglia è selezionato automaticamente) come indicato dalla freccia blu. Questa casella può essere regolata utilizzando i quadrati sui lati e gli angoli per renderla più grande o più piccolo. La freccia verde rappresenta la fine della perinexus, che l’utente deve assicurarsi rimane “aperta”. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Le dilatazioni seriale immagine. La struttura binaria è ripetutamente dilatata in incrementi di un pixel (A-D) e aggiunti all’immagine di lavoro (la forma non-binario dell’immagine, E-H) dopo ogni dilatazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: path-finding e isolamento di linea di mezzeria. Un derivato spaziale viene calcolato dall’immagine lavoro finale (A) e la grandezza di quella derivata spaziale (B) viene utilizzata per isolare la struttura e la linea di mezzeria (frecce bianche). Una soglia definita dall’utente identifica il contorno e linea d’asse e sottraendo il contorno originale produce la linea di mezzeria (D). Tuttavia, le lacune vengono visualizzati in linea d’asse a causa della soglia (D – inserire). Al fine di produrre una linea di mezzeria continua, una dilatazione secondaria viene eseguita sull’asse di mezzeria isolato (E), seguita da un’erosione secondaria per aumentare l’efficienza computazionale di un algoritmo di path-finding successive. Questa immagine erosa (F) è poi combinata con l’immagine finale del lavoro, che consenta l’identificazione di una linea d’asse continuo, uno-pixel-spesso (G – inserire). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Presentazione dei dati finale. Il programma restituisce il profilo finale sopra l’immagine originale di TEM (A). La linea è verde color-coded per 0-150 nm, blu per la regione definita dall’utente di interesse e rosso per la zona oltre 150 nm. Inoltre, il programma genera un grafico allo stesso modo con codifica a colori che rappresentano Wp in funzione della distanza dall’inizio del perinexus e per la regione di interesse (B), così come la media Wp (inserto nel rispettivo grafico). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 : Analisi della forma di dilatazione kernel. Forme per i kernel di dilatazione (A): la stella al centro rappresenta i pixel dilatati. Scatole bianche sono colpiti dalla dilatazione, a forma di un plus, X, casella o linea di pixel. Un perinexus circa orizzontale (B, superiore, con una linea rossa che indica 0°) è stata ruotata in senso orario da 0 a 180° in incrementi di 10° e ripetutamente dilatata utilizzando le forme di kernel diverso (B, in basso). Kernel e linea-a forma di più produrre risultati simili, anche se il kernel di linea non riesce a determinati orientamenti, mentre i kernel e X-a forma di scatola sono sfasate di 45 °. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8 : Orientamento correzione immagine. A corretto per l’orientamento dell’immagine, l’angolo medio del perinexus viene calcolato dalle posizioni dell’inizio – ed end punti (A, a sinistra, inizio e fine della linea nera). La tangente inversa del cambiamento nella direzione y (A, sinistra, linea verde) diviso per il cambiamento nei rendimenti di direzione x (A, sinistra, linea rossa) l’angolo di correzione, θ (A, a sinistra, gialla). L’obiettivo è quindi di correggere il valore dip W medio per dare la distanza minima tra i bordi, come se la perinexus era stato ripreso circa orizzontalmente (A, qui sotto a sinistra). L’applicazione del fattore di correzione descritto dall’equazione 1 è stato confrontato manualmente ruotando ciascuna delle 15 immagini selezionati in modo casuale da θ calcolata prima dell’analisi. I corretti valori fortemente correlati con i valori dell’immagine ruotata (R2 = 0.991, A, destra), che indica di equazione 1 è un fattore di correzione valido per orientamento dell’immagine. Per confermare che il fattore di correzione è appropriato, due fantasmi sono stati generati dei bordi perfettamente parallelo con una distanza nota tra di loro (B, a sinistra). Phantom 1 e Phantom 2 hanno risoluzioni spaziali 2,833 pixel / mm e 71,6 pixel/pollici, rispettivamente. Come dimostrano i diamanti blu e rossi piazze in B, bene, l’algoritmo calcola con precisione le larghezze in tutto 180 gradi di rotazione dell’immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9 : Riproducibilità algoritmo. Con il processo automatico con correzione orientamento dell’immagine, osservatore esperto e inesperto trovato differenze significative tra AF e AF No gruppi (A), coerenti con uno studio precedente, rilevando una differenza minima di 2,6 nm. Inoltre, né osservatore trovato una differenza significativa in Jan (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Manuale Automatico Tempo – OBS. 1 (s) 205±11 44±14 Tempo – OBS. 2 (s) 248±18 30 ± 5 Risoluzione spaziale (misure/nm) 0.08 3,45 Tabella 1: confronto dei processi manuali e automatici. Entrambi gli osservatori richiesto meno tempo per ogni immagine per tracciare il contorno di to eseguire il processo di segmentazione manuale per un 10-immagine training set. Inoltre, il processo automatico ha una maggiore frequenza di campionamento, registrazione 3,45 misurazioni al nm, rispetto a una media di 1 misura ogni 12,5 nm per il processo manuale. Le immagini del set di formazione si trovano in supplementare File S5, insieme a contorni e misurazioni interpretato da un utente esperto.