לכימות מרחקים Intermembrane עם תמונות טורי Dilations

שיטות סטטיסטיות: נערכו השוואות בין קבוצות הניסוי באמצעות t של סטודנט-הבדיקות. ערך-p < 0.05 הוא נחשב משמעותי, כל הערכים מיוצגים בתור הממוצע ± סטיית התקן. פילוח ידנית. כימות של הרוחב nanodomain perinexus GJ סמוכים (Wp) מושגת בדרך כלל על ידי פילוח ידנית. תהליך ידני פילוח זה הוכח איור 1א’ והיה שתוארה לעיל6. הצופה מזהה קצה ושחבר המושבעים הגדול (איור 1, נקודה אדומה), מודד את 5nm לאורך מרכז perinexus, מודד את המרחק בין הממברנות בנקודה זו. התהליך זה חוזר על עצמו שוב ב 10, 15, 30 וכל 15 ננומטר עד 150 ננומטר. טכניקה זו, בעוד יעיל, יש מגבלות של זמן ושל מרחבי תת דגימה לאורכו של perinexus. כלומר מדידותp W ממחקרים קודמים יכול להשתנות כ 10 עד 20 ננומטר2,3,10ו- 3 ננומטר שנראה ההבדל הממוצע הדרוש כדי לזהות מובהקות סטטיסטית, שהינו מעל תדר נייקוויסט המרחבי של 0.7 nm לכל מדידה המבוססת של פתרון interpixel של 0.34 ננומטר. לכן, בעוד פילוח ידני הוא זמן רב, השיטה זו מספיקה כדי למדוד הבדלים ב- Wp הקשורים למצב של התערבות או מחלה. תמונה טורי Dilations. על מנת למדוד את perinexus בצורה מהירה יותר, לשחזור עם רזולוציה מרחבית המתאים, פיתחנו תוכנית המבוססת על תמונת טורי dilations לספור את הפיקסלים בין ממברנות ידנית איתרו שני, אשר ניתן לראות באיור 1B . תהליך התרחבות טורי מודגם באיור4. כמו התמונה בינארי הוא מורחבים (איור 4A-4D), כי התארכות ואז הפוכה, נוסף על תמונת עבודה – הטופס שאינו בינארי של החלוקה לרמות המקוריים (איור 4EH -4). התהליך חוזר על עצמו עד לרמות מתמלא לחלוטין (איור 4D). בשלב זה, התמונה העבודה הסופית (איור 4H) הוא ספירה של מספר הפעמים שפיקסל מסוים נשארה לא מתרחבים. ככזה, הערכים ליד קו המתאר של קרום התא הם נמוך מאוד, בעוד שהערכים במרכז הם הגבוהים ביותר. על-ידי ספירת מספר dilations למלא את האזור בכל נקודה, ניתן לחשב את המרחק בין הקצוות ממברנה. האתגר הבא הוא לזיהוי ולבידוד האמצע כדי לכמת את רוחב perinexal כפונקציה של מרחק GJ, אשר נעשה על-ידי החלת הראשון נגזרת מרחבי התמונה הסופית של העבודה (איור 2-התמונה האחרונה, ואת איור 5 A). דוגמה שנייה perinexus יותר ומתפשטים בצורת ניתן למצוא בקובץ משלימה S3. זיהוי האמצע. ניתן לכמת את מעבר הצבע של התמונה הסופית של העבודה מאת נגזרת המרחבי, כמו התרחבות ספירת ערכים מקצה לקצה לשנות מן הגבוה לנמוך כדי גבוהה שוב (איור 5A משמאל לימין). בהתחשב רק את סדר הגודל של הנגזרת המרחבי (איור 5B), החלונית מיתאר ואת האמצע, מודגש באמצעות החצים הלבנים, הן לזיהוי מיידי כאזורים של רציפות. במקומות אלה, משנה כיוון מעבר הצבע מהעלאת להפחתת או להיפך. החלת סף (איור 5C) מייצר תמונה בינארית של האמצע, חלוקה לרמות, הפחתה המתאר המקורית התשואות האמצע מבודד (איור 5D). אמנם שיטה זו של בידוד האמצע שהמפתחות יעיל, הסף שהוחל הנגזרת המרחבי יוצר פערים האמצע וכתוצאה מכך. פערים אלה (איור 5D, להוסיף) יש למלא כדי לספק של מדידה מדויקת של המרחק מן ושחבר המושבעים הגדול, כדי להבטיח ש-perinexus נמדד בשלמותו. ראשית, האמצע הוא מורחבים כדי למלא פערים כלשהם (איור 5E), ואחריו סחף (איור 5F), פונקציה “bwmorph” (מבצע = ‘סקל’, n = inf) לחסל את נקודות רבות ככל האפשר תוך השארת האמצע רציפה, ובכך מגדיל את יעילות חישובית באלגוריתם עוקבות pathfinding שפותחה על ידי Limprasert ואסט וזמין על מרכזי MATLAB9. פונקציה זו התרחבות ארוזיה מייצרת האמצע שהושלמו, אשר בשילוב עם התמונה הסופית עבודה (איור 5G). עם זאת, זה האמצע הוא לרוב בעובי פיקסל אחד או יותר, ולכן הוא לא בידוד מדויק של האמצע. האלגוריתם pathfinding Limprasert ואסט משמש כדי לקבוע האמצע perinexus. האלגוריתם pathfinding הוא מסוגל לאתר הערכים הגבוהים ביותר – במקרה זה את הערכים הכי קרוב למרכז אשר נותרה לא מתרחבים דרך הכי איטראציות לאורך האמצע (איור 5G, להוסיף). התוצאה היא מעקב אוטומטי של האמצע, כפי שמוצג באיור 6. על-ידי בידוד האמצע, רוחב perinexal ניתן להציג כפונקציה של מרחק מהקצה של GJ, כפי שמוצג באיור 6B (למעלה), או את רוחב ממוצע של אזור מסוים של עניין. ניתוח ליבה. חשוב לשים לב כי תמונות דיגיטליות מבוססות על מערכים מרובע, התארכות גרעינים מבוססים גם על מטריצות ריבועיות. משמעות הדבר היא כי התארכות מרחק לאורך אלכסון גדול מ אורתוגונלית. לכן, אנחנו הבאה ביקשו לקבוע אם הקרנל מושפעות התוצאות של האלגוריתם. על מנת לכמת את השתנות ליבה ספציפית, נותחו חמש צורות שונות ליבה: “פלוס” (הצורה בשימוש הבדיקות לעיל) “X”, “התיבה”, “קו”, כפי שמתואר איור 7א. הליבה מיושמת בכל נקודה אפס תמונה בינארית. הכוכב של כל ליבה של איור 7א מייצג את המרכז, שבו הלבן הוא ערך של 1, שחור הוא ערך של 0 עבור הקרנל התרחבות. ההשפעה הליבה: כל על המידהp W אכזרי של תמונה אופקי כ perinexal אחת (איור 7ב’, העליון), לכמת על-ידי משתמש מנוסה, נקבע על-ידי סיבוב התמונה באמצעות הפקודה “imrotate” של Matlab ו מחשוב Wp בשלבים של 10 מעלות. Wp מדידה הערכים (איור 7ב’, התחתון) משתנים עם כיוון תמונה בצורה sinusoidal לתקן בתוספת בצורת ליבה. הערכים הנמוכים ביותר מתרחשות כאשר perinexus יחסית ישר מכוון אנכית או אופקית. גרעינים לא X, תיבת, ולא שורה מסופקים כל יתרון על פני הקרנל בצורת פלוס. גרגירים X ותיבת לתוצאות זהות, אבל הערכים של אומר Wp היו שלב עם the בתוספת הקרנל מאת 45 °. הקרנל קו נכשלה לחלוטין להתרחב התמונה בזוויות מסוימות, כפי שניתן לראות בגלל היעדר נתונים המעקב ירוק לתמונות מסובב פחות מ- 30 או יותר 145 °. לפיכך, הקרנל התארכות פלוס אורתוגונלית הפרזתי ממברנה ההפרדה כאשר להרחבת של perinexus עם ציר מונחה באלכסון לדוגמה כ 45 °, גרגירים X ותיבת המעיט אומר Wp מתי לציר הארוך של perinexus היה גם ב- 45 מעלות. בהתבסס על ניתוח זה, פיתחנו פקטור התיקון חלה על הערכים המופקים להרחבת עם הקרנל בצורת פלוס. כדי להסביר מופרזת של ממברנה ההפרדה המשויך כיוון תמונה, זה פקטור התיקון כפול הערך רוחב נמדד בהתאם הכיוון של התמונה (משוואה 1). אם θ באמצעות < 45°      Wp תוקן = cosd(θ באמצעות) * Wp נמדד אם θ באמצעות ≥45 °      Wp תוקן = cosd(θ באמצעות) * Wp נמדד (משוואה 1) במשוואה הזו, Wp שנמדד הוא הערך המקורי שלp W שנוצר על ידי לעיל האלגוריתם θ באמצעות הוא מחושב זווית אופקית, במעלות. Θ באמצעות מחושבת על ידי לקיחת הטנגנס ההופכי של השינוי הכולל בכיוון אופקי חלקי סה כ השינוי בכיוון אנכי האמצע perinexal. התיקון הנ ל קירוב זווית הממוצע, יחסית אופקי, של perinexus (איור 8א, השמאלי-העליון) ותוצאות מדידה כאילו המתקבל perinexus אופקי (איור 8א, למטה משמאל). הרציונל מאחורי המשוואה הזו נובעת מהעובדה כי הקרנל בצורת פלוס (איור 7א) הוא בעצם שני בצורת קו גרעינים מסודרים orthogonally אחד לשני. ככזה, מתחת 45° (קרוב אופקי), dilations להתרחש אנכית ונותן ולכן הכפלת הקוסינוס של הזווית המדידה הנכונה. לעומת זאת, עבור זוויות מעל dilations (קרוב יותר אנכית), 45° מתרחשות אופקית, הסינוס משמשת כדי לקבוע את המידה הנכונה. בדיוק 45°, סינוס, קוסינוס הם שווים. קובץ משלים S4 מספק תיאור של רעיון זה. שים לב תיקון זה מבוסס על הזווית הממוצע, זהירות אמור לשמש בעת ניתוח צורות באופן משמעותי שאינו ליניארי. תהליך זה חזר על עצמו על 20 perinexi שנבחר באופן אקראי, המדידות המתוקן בקורלציה חזקה עם מדידות מתקבל על ידי באופן ידני סיבוב וניתוח מחדש את התמונות (איור 8א, נכון). כדי לאשר את התיקון מדויק עבור כיוון תמונה, שתי קבוצות של קצוות הפנטום היו שנוצר (איור 8ב’, משמאל) לסובב 180 מעלות. עם התיקון טריגונומטריות, האלגוריתם חזר במדויק את הערך הנכון בשעה בכל כיוון, ללא תלות ברזולוציה מרחבית או גודל תמונה (איור 8ב’, נכון). יישום אנליטית, הפארמצבטית עם אוריינטציה תיקון. נזכר כי מחקרים קודמים באמצעות דו ח פילוח ידנית סטטיסטית מתכוון Wp ההבדלים גדול מאו שווה ל- 3 ננומטר, שזה חשוב לקבוע אם אלגוריתם יכול לשמש כדי לסכם ממצאים קודמים באמצעות ערכת נתונים מלאה. באמצעות אלגוריתם חדש, שני משקיפים – אחד מנוסה ואחד לתקלה עם ניתוח perinexal (תשיג 1 ו- 2 תשיג, בהתאמה)-ניתחו תמונות מאותו מ הקודם מחקר6 שכלל 12 חולים שאובחנו עם פרפור פרוזדורים (AF) לפני הרקמה אוסף ומטופלים 29 זה לא היו קיימים AF (לא-AF). המשתמש מנוסים נמצא כי Wp היה רחב יותר משמעותית בחולים עם AF מאשר בלי AF (nm 21.9±2.5 ו- 18.4±2.0, בהתאמה, איור 9א). ערכים אלה עם פקטור התיקון מוחל דומים הללו שדווחו בעבר (24.4±2.2 nm ו 20.7±2.4 ננומטר, בהתאמה)6. חשוב, למשתמש לא מנוסה מצא הבדל משמעותי (22.1±2.8 nm ו 20.1±2.6 ננומטר, בהתאמה) בין מצבי מחלה עם התוכנית האוטומטית. בנוסף, סטיית התקן של הערכיםp W לא השתנו עם פקטור התיקון, המציין שסטיית התקן של 2-3 ננומטר הוא לא חפץ של האלגוריתם, אבל המבנה עצמו ועיבוד רקמה. תוצאות אלו מדגימים כי השיטה המוצעת האוטומטי הוא מסוגל recapitulating את התוצאות של מחקרים קודמים. חשוב, perinexus הוא מבנה הגדיר לאחרונה, אין הסכמה הושגה על טווח הערכים המוחלטים של ממברנה ההפרדה סמוך GJ2,3. מאז החיצוני-ממברנה-כדי–הממברנה החיצונית GJ רוחב הוערך בעבר ב 20 nm13, חיפשנו לקבוע את היעילות של האלגוריתם על ידי גם מדידת רוחב GJ. שני משקיפים מצאו שום הבדל משמעותי בין הפער צומת רוחבי (GJW) של חולים עם או בלי קיימים AF (איור 9ב’). ערכים מוחלטים GJW עבור AF וחולים -AF היו 20.5 ± 2.5 ננומטר, 20.3 ± 1.9 nm, בהתאמה, עבור המתבונן מנוסים ו ננומטר ± 3.1 21.0 20.0 nm ± 2.2 עבור המתבונן חסר ניסיון, הדומה מה שדווח קודם לכן. כדי לקבוע האלגוריתם אוטומטיות נדרש פחות זמן כדי לנתח נתונים מאשר פילוח ידנית, הן שהמשתמש מנוסה וחסרת הקליט את הזמן צריך לכמת אימונים 10-תמונה של הגדר (קובץ משלים S5). טבלה 1 מדגים כי המשתמש מנוסה וחסרת ירד זמן ניתוח על ידי 4.7 – ו 8.3 פי בהתאמה באמצעות האלגוריתם אוטומטיות ביחס הגישה פילוח ידנית, עם גידול כ 43-fold המרחבי רזולוציה לאורך perinexus. אלגוריתם לפתרון בעיות. השגיאה הנפוצה ביותר בעת הרצת האלגוריתם מתרחשת כאשר האמצע הסופי אינו מסתיים בקצה של התמונה. במקרים כאלה, לא מספיק נקודות נבחרו מן המפה נגזרות המרחבי, גורמת לתוכנית להיכשל ולייצר הודעת שגיאה ייעוץ למשתמש לבחור אזור חיתוך גדול יותר או להגדיל את סף נגזרות המרחבי. שרטוט תיבה יבול גדול יותר, תוכלו לשפר את המהימנות של התוכנית במקרים מסוימים כאשר משתנה נגזרות מרחבית באופן דרסטי ליד הקצוות של הדמות, אשר יכול לשבש את האלגוריתמים זיהוי pathfinding או קצה. זה גם אפשרי עבור אלגוריתם ה-pathfinding להיכשל לזהות כראוי את האמצע, גם אם האמצע מגיע לקצה של התמונה, במיוחד אם הסף הדרגתיות נמוך מדי (איור 2א). אם סף מעבר צבע מוגדרת גבוה מדי, יהיו יותר נקודות שאינן נחוצות שולבו האלגוריתם pathfinding (איור 2B), הפחתת יעילות חישובית. אם המשתמש אינו מסוגל לקבוע על הסף המתאים, מערך התמונה “GMag” (איור 2C), אשר נוצר על-ידי התוכנית, ניתן למצוא בסביבת העבודה, יכול לעזור למשתמש לקבוע את הסף. למצוא נקודות לאורך האמצע ולהגדיר את הסף מעט מעל שלהם ערך האינדקס כדי להבטיח שנקודות אלה נבחרו. בדוגמה הנתונה, סף המתאים יהיה מעל ~5.1 (איור 2C, להוסיף). נקודת ההתחלה עלולה להיכשל גם להגיע לתחילת perinexus (איור 2D). במקרה זה, הפעל מחדש את התוכנית והגדר את הערך ידני להתחיל ל- 1. אחרי האמצע היה מבודד, המשתמש בוחר נקודת בחוץ perinexus, נקודת האמצע הקרוב ביותר לצבע הפיקסל שנבחר (איור 2E, הכיכר האדומה) יוגדרו נקודת ההתחלה. התוצאה היא האמצע מלא (איור 2F). איור 1 : TEM תמונות עם תהליכים כמת. תהליך פילוח ידנית (א) מחייב את המשתמש לבצע מדידות intermembrane 12 בעת הערכת האמצע. תהליך אוטומטי (B) דורש מעקב ידני, רציף של החלוקה לרמות של perinexus. הנקודה האדומה בתמונה כל מייצג המשתמש מזוהה סוף ושחבר המושבעים הגדול ותחילת perinexus. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.  איור 2 : פתרון בעיות האמצע. שני ראשי מצבי כשל הזיהוי האמצע ופתרונות שלהם: כל תמונה מתויג בשם מערך ב- Matlab. אם הסף הדרגתיות היא גם נמוכה (א, סף 0.2) האלגוריתם האמצע יכול להיכשל. קביעת סף גבוה מדי (B, סף 70) יכולים להפחית את היעילות חישובית של האלגוריתם pathfinding. סף מעבר הצבע המתאים יכול להיקבע מן המערך GMag (C, להוסיף). אם האמצע לא יצליח להגיע לקצה מתחיל perinexus (ד), המשתמש יכול לבחור כדי לבחור באופן ידני את נקודת ההתחלה. לאחר “להתחיל נקודת” אפשרות מוגדר כ- 1 ב- GUI הפתיחה, המשתמש ואז בוחר של נקודת בחוץ perinexus של עניין (E). התוצאה הסופית צריכה להיות האמצע במדויק מתאר את מכלול של perinexus (נ). תוויות כל הצעות המחיר (A-F) תואמים את שמות המשתנים ב- Matlab. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : מבחר Perinexus. כדי לחתוך את perinexus, לחץ-and-להחזיק לגרור תיבה מסביב (הכלי ‘ חיתוך ‘ מסומנת באופן אוטומטי) כפי שמוצג על ידי החץ הכחול. יכול להיות מותאם תיבת זו על-ידי שימוש הריבועים בצדדים ובפינות לעשות את זה גדול או קטן יותר. החץ הירוק מייצג את סוף perinexus, שבו המשתמש צריך לוודא נשאר “פתוח”. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : התמונה טורי dilations. החלוקה לרמות בינארי הוא שוב ושוב מורחבים במרווחים של פיקסל אחד (י-ם) והוסיף בתמונה עובד (טופס שאינו בינארי של התמונה, E-H) לאחר כל התרחבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: בידוד האמצע ו- pathfinding. נגזרת המרחבי מחושבת על פי התמונה הסופית של העבודה (א) ומשמש סדר הגודל של זה נגזרת המרחבי (ב) כדי לבודד את החלונית מיתאר ואת האמצע (החצים הלבנים). סף מוגדר-משתמש מזהה את קווי המתאר ותשואות האמצע ומחסר המתאר המקורית האמצע (D). עם זאת, מופיעים פערים האמצע כתוצאה הסף (D – הכנס). על מנת לייצר האמצע רציפה, התארכות משני מתבצע על האמצע מבודד (E), ואחריו שחיקה משני כדי להגביר את היעילות חישובית של אלגוריתם pathfinding הבאים. תמונה זו השחוקים (נ) אז בשילוב עם התמונה הסופית עבודה, המאפשר זיהוי האמצע, רציף אחד בעובי פיקסל (G – הכנס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6 : מצגת נתונים הסופי. התוכנית פלטי המתאר הסופי על גבי התמונה המקורית TEM (א). הקו הוא בצבע ירוק 0-150 nm, כחול עבור האזור על-ידי המשתמש של ריבית ו אדום מסמל האזור מעבר 150 ננומטר. בנוסף, התוכנית פלטי תרשים באופן דומה בצבעים המייצגים Wp כפונקציה של המרחק מן ההתחלה של perinexus ועבור האזור עניין (B), כמו גם ממוצע Wp (שיבוץ בגרף בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7 : התארכות ליבה צורת ניתוח. צורות עבור התרחבות גרעינים (א): הכוכב באמצע מייצג את הפיקסלים מורחבים. תיבות לבנות הם פיקסלים מושפעות על ידי התרחבות, בצורת פלוס, X, תיבת או קו. Perinexus כ אופקי (ב’, בראש, עם קו אדום המציין 0°) היה לסובב בכיוון השעון מ- 0 180 ° בשלבים של 10° שוב ושוב מורחבים באמצעות הצורות ליבה שונים (B, התחתון). פלוס, קו-בצורת גרעינים לייצר תוצאות דומות, למרות הקרנל קו נכשלת בזמן כיוונים מסוימים, ואילו תיבת ו X-בצורת גרגירים את שלב על ידי 45 °. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 8 : תמונה תיקון כיוון. כדי הנכון האוריינטציה של התמונה, זווית הממוצע perinexus מחושבת על פי העמדות של ההתחלה – ואת הקצה – points (א, שמאל, ההתחלה והסוף של קו שחור). הטנגנס ההופכי של שינוי כיוון y (, שמאלה, ירוק קו) לחלק השינוי ב- x-כיוון (, שמאלה, אדום קו) את התשואות את תיקון זווית θ באמצעות (, שמאלה, צהוב). המטרה היא לתקן את הערך הממוצע שלp W כדי לתת את המרחק המינימלי בין הקצוות, ואז כאילו היה כבר צילמו את perinexus כ אופקית (משמאל, להלן). היישום של פקטור התיקון המתואר על ידי משוואה 1 הושווה ידנית סיבוב אחד של 15 תמונות שנבחרו באופן אקראי על ידי θ באמצעות מחושב לפני ניתוח. הערכים המתוקן חריפה בקורלציה עם הערכים תמונת-מסובב (R2 = 0.991, A, נכון), המציינת את משוואה 1 הוא גורם תיקון חוקי לאוריינטציה התמונה. לאשר שפקטור התיקון הוא המתאים, נוצרו שני מטוסי פאנטום של קצוות בצורה מושלמת-מקבילית עם מרחק ידוע ביניהם (B, משמאל). פנטום 1 ו- 2 פנטום יש החלטות המרחבי של פיקסלים 2.833 / מ מ. ו- 71.6 פיקסלים/פנימה, בהתאמה. כפי שמוצג על ידי יהלומים כחולים ריבועים אדומים ב’, נכון, האלגוריתם במדויק מחשבת רוחבן לרוחב 180 מעלות של סיבוב תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 9 : אלגוריתם הפארמצבטית. באמצעות תהליך אוטומטי עם התמונה כיוון תיקון, שני משקיף מנוסה וחסרת מצאו הבדלים משמעותיים בין AF לא-AF קבוצות (א), בקנה אחד עם מחקר קודם, זיהוי הבדל מזערי של 2.6 ננומטר. בנוסף, הצופה לא נמצא הבדל משמעותי ב- GJW (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. ידני אוטומטי זמן – תשיג 1 (s) 205±11 44±14 זמן – תשיג 2 (s) 248±18 30±5 רזולוציה מרחבית (המידות/ננומטר) 0.08 3.45 טבלה 1: השוואה של תהליכים ידניים ואוטומטיים. שני משקיפים נדרש פחות זמן לכל תמונה לאתר את החלוקה לרמות יותר כדי לבצע את התהליך. פילוח ידנית עבור ערכת הדרכה תמונת-10. בנוסף, תהליך אוטומטי כולל גבוה יותר תדר הדגימה, הקלטה מדידות 3.45 לכל nm, לעומת ממוצע של מדידה 1 12.5 כל nm עבור תהליך ידני. ניתן למצוא תמונות ערכת הדרכה ב- S5 קובץ משלים, יחד עם קווי מתאר ומדידות כפי שבוצעה על-ידי משתמש מנוסה.