Quantification des Distances intermembranaire avec Serial Image dilatations

Méthodes statistiques : Des comparaisons ont été faites entre les groupes expérimentaux à l’aide du test t de Student. Une valeur p < 0,05 est considérée comme significative et toutes les valeurs sont représentées comme moyenne ± écart-type. Segmentation manuelle. La quantification de la largeur de nanodomain perinexus GJ adjacente (W,p) est généralement accomplie par segmentation manuelle. Ce processus de segmentation manuelle est illustré dans la Figure 1A et a été décrit précédemment6. L’observateur identifie le bord de la GJ (Figure 1, point rouge), mesure 5 nm le long du centre de la perinexus et mesure la distance entre les membranes à ce moment-là. Le processus est ensuite répété à 10, 15, 30 et toutes les 15 nm jusqu’à 150 nm. Cette technique, bien qu’efficace, a ses limites de temps et spatiale sous échantillonnage le long de la perinexus. Veux dire mesuresp W d’études antérieures peuvent varier d’environ 10 à 20 nm2,3,10et 3 nm semble être la différence moyenne nécessaire pour détecter la signification statistique, qui est nettement supérieur à la fréquence de Nyquist spatiale de 0,7 nm par mesure selon une résolution interpixel de 0,34 nm. Alors que la segmentation manuelle prend beaucoup de temps, la méthode est donc suffisante pour mesurer les différences de Wp associé à un état de l’intervention ou la maladie. Image série dilatations. Afin de mesurer la perinexus d’une manière plus rapide et reproductible avec une résolution spatiale appropriée, nous avons développé un programme basé sur les dilatations série image à compter les pixels entre deux membranes tracée manuellement, ce qui peuvent être vu dans la Figure 1B . Le processus de dilatation série est illustré à la Figure 4. Comme l’image binaire est dilatée (Figure 4 a-4D), que la dilatation est alors inversée et ajoutée à une image de travail – non binaire consistant en l’esquisse originale (Figure 4E-4 H). Le processus est répété jusqu’à ce que le contour est entièrement rempli (Figure 4D). À ce stade, l’image finale du travail (Figure 4H) est le nombre de fois qu’un pixel particulier est resté non dilaté. Par conséquent, les valeurs près le contour de la membrane cellulaire sont très faibles, tandis que les valeurs au centre sont les plus élevés. En comptant le nombre de dilatations pour remplir la zone à chaque point, la distance entre les bords de la membrane peut être calculée. Le prochain défi est d’identifier et d’isoler la ligne médiane pour quantifier perinexal largeur en fonction de la distance de la GJ, qui se fait en premier s’appliquant à un dérivé spatial à l’image finale du travail (Figure 2-dernière image et Figure 5 A). Un deuxième exemple d’une perinexus plus irrégulière se trouvent dans le fichier complémentaire de S3. Axe Identification. Le gradient de l’image finale du travail peut être quantifié en un dérivé spatial, comme comte de dilatation modification des valeurs du bord à bord de forte à faible à élevée à nouveau (Figure 5A de gauche à droite). Considérant seulement l’ampleur de la dérivée spatiale (Figure 5B), le contour et le trait d’axe, mis en évidence par les flèches blanches, sont immédiatement identifiables comme des zones de discontinuité. À ces endroits, la direction de gradient change d’augmenter à la baisse, et inversement. Application d’un seuil (Figure 5C) produit une image binaire de la ligne médiane et le contour, et en soustrayant l’esquisse originale donne l’axe isolé (Figure 5D). Alors que cette méthode consistant à isoler l’axe central est efficace par le calcul, le seuil appliqué au dérivé spatial crée des vides dans l’axe qui en résulte. Ces lacunes (Figure 5D, insérer) doivent être remplis pour fournir une mesure précise de la distance de la GJ et pour maintenir que la perinexus est mesurée dans son intégralité. Tout d’abord, l’axe central est dilaté pour combler les trous (Figure 5E), suivie d’une érosion (Figure 5F) et une fonction « bwmorph » (opération = « skel », n = inf) d’éliminer autant de points que possible tout en laissant une axe central continu, ce qui augmente l’efficacité de calcul d’un algorithme de pathfinding ultérieures développé par Wasit Limprasert et disponible sur MATLAB Central9. Cette fonction de dilatation-érosion produit l’axe dûment rempli, qui est associé à l’image finale du travail (Figure 5G). Toutefois, cet axe est souvent plus d’un pixel d’épaisseur et n’est donc pas un isolement précis de l’axe central. L’algorithme de pathfinding de Wasit Limprasert est utilisé pour déterminer l’axe de perinexus. L’algorithme de pathfinding est en mesure de suivre les valeurs les plus élevées – dans ce cas les valeurs plus proches du centre, qui est resté non dilaté par le biais de la plupart des itérations le long de l’axe (Figure 5G, insérer). Il en résulte une trace automatique de l’axe central, tel qu’illustré à la Figure 6. En isolant l’axe central, perinexal largeur peut être présenté en fonction de la distance entre l’extrémité de la GJ, comme illustré à la Figure 6B (en haut), ou comme la largeur moyenne d’une région déterminée d’intérêt. Noyau analyse. Il est important de noter que les images numérisées sont basées sur des tableaux carrés et noyaux de dilatation sont également issu des matrices carrées. Cela signifie que la distance de dilatation dans une diagonale est supérieure à orthogonale. Par conséquent, nous avons voulu ensuite déterminer si le noyau influé sur les résultats de l’algorithme. Afin de quantifier la variabilité spécifique du noyau, on a analysé les cinq formes différentes de noyau : «Plus» (la forme utilisée dans les analyses ci-dessus), «X», «boîte» et «ligne», tel que décrit dans la Figure 7A. Le noyau est appliqué à chaque point zéro d’une image binaire. L’étoile dans chaque noyau de Figure 7A représente le centre, où blanc est une valeur de 1 et le noir est une valeur de 0 pour le noyau de la dilatation. Influence de chaque noyau sur la mesure dep W moyenne d’une seule image perinexal approximativement horizontale (Figure 7B, top), quantifiée par un utilisateur expérimenté, a été déterminé par la rotation de l’image avec la commande « imrotate » de Matlab et calcul de Wp par paliers de 10 °. Les valeurs de mesurep W (Figure 7B, bas) fluctuent avec l’orientation de l’image de manière sinusoïdale rectifiée avec un Plus en forme de noyau. Les valeurs les plus basses se produisent quand une perinexus relativement rectiligne est orienté verticalement ou horizontalement. Le X, ni boîte, ni ligne noyaux fournis aucun avantage sur le noyau en forme de plus. Les noyaux X et boîte produit des résultats identiques, mais les valeurs des moyennes Wp étaient déphasés avec the noyau de Plus de 45 °. Le noyau de la ligne n’a pas pleinement dilater l’image à certains angles comme on le voit par l’absence de données dans la trace verte pour tourner des images de moins de 30 ou plus de 145 °. Ainsi, le noyau de dilatation orthogonal Plus surestimé séparation par membrane lorsque dilater un perinexus avec un axe orienté en diagonale par exemple à environ 45 °, et les noyaux X et boîte sous-estimé moyenne Wp quand l’axe longitudinal de la perinexus était aussi à 45°. Selon cette analyse, nous avons développé un facteur de correction appliqué aux valeurs de dilatation avec le noyau en forme de plus. Pour tenir compte de la surestimation de séparation par membrane liée à l’orientation de l’image, ce facteur de correction multiplié par la valeur de la largeur mesurée selon l’orientation de l’image (équation 1). Si θ < 45°      Wp corrigé = cosd(θ) * Wp mesurée Si θ ≥45 °      Wp corrigé = cosd(θ) * Wp mesurée (équation 1) Dans cette équation, Wp mesurée est la valeur dep W origine générée par l’algorithme ci-dessus et le θ est l’angle calculé de l’horizontal, en degrés. Θ est calculé en prenant la tangente inverse de la variation totale dans le sens horizontal divisé par le changement total dans la direction verticale de l’axe perinexal. Ces corrections rapproche de la pente moyenne, par rapport à horizontale, de la perinexus (Figure 8A, haut à gauche) et se traduit par une mesure que si elles proviennent d’un perinexus horizontal (Figure 8A, bas à gauche). Le raisonnement derrière cette équation provient du fait que le noyau en forme de plus (Figure 7A) est essentiellement deux noyaux en forme de ligne et disposés perpendiculairement les uns aux autres. À ce titre, inférieure à 45° (plus près à l’horizontale), les dilatations se produisent verticalement et donc en multipliant par le cosinus de l’angle donne la mesure correcte. À l’inverse, pour les angles au-dessus de dilatations (proches de la verticale), 45° se produisent horizontalement et le sinus est utilisé pour déterminer la mesure correcte. Précisément à 45 °, le sinus et cosinus sont égaux. Fichier supplémentaire S4 fournit une représentation de ce concept. Notez que cette correction est basée sur l’angle moyen et soyez prudent lors de l’analyse des formes sensiblement non linéaire. Ce processus a été répété sur 20 perinexi choisis au hasard et les mesures corrigées fortement corrélée avec les mesures obtenues en tournant manuellement et en ré-analysant les images (Figure 8A, droite). Pour confirmer la correction exacte pour l’orientation de l’image, deux séries d’arêtes fantômes ont été générés (Figure 8B, à gauche) et tourné de 180 °. Avec la correction trigonométrique, l’algorithme revient avec précision la valeur correcte de chaque orientation, quelle que soit la résolution spatiale ou de la taille de l’image (Figure 8B, droit). Application analytique et la reproductibilité avec Correction de l’Orientation. Rappelant que des études antérieures à l’aide du rapport de segmentation manuelle statistiquement significative Wp différences supérieures à moyennes ou égal à 3 nm, il était important de déterminer si l’algorithme pourrait être utilisé pour récapituler les résultats précédents à l’aide une ensemble complet de données. En utilisant le nouvel algorithme, deux observateurs – un vécu et un unexperienced avec analyse perinexal (Obs. 1 et Obs. 2, respectivement)-analysé les mêmes images d’une précédente étude6 qui comprenait 12 patients qui ont été diagnostiqués avec l’auriculaire fibrillation auriculaire (FA) avant prélèvement tissulaire et 29 patients qui n’avaient pas de AF préexistante (non-AF). Les utilisateurs expérimentés trouvent que Wp était sensiblement plus large chez les patients avec l’AF que sans AF (21.9±2.5 et 18.4±2.0 nm, respectivement, Figure 9A). Ces valeurs avec le facteur de correction appliquées sont similaires à celles rapportées précédemment (24.4±2.2 nm et 20.7±2.4 nm, respectivement)6. Ce qui est important, l’utilisateur inexpérimenté a constaté la même différence significative (22.1±2.8 nm et 20.1±2.6 nm, respectivement) entre les États de la maladie avec le programme automatisé. En outre, l’écart type des valeursp W n’a pas changé avec le facteur de correction, ce qui indique l’écart de 2-3 nm n’est pas un artefact de l’algorithme, mais de la structure elle-même et le traitement des tissus. Ces résultats démontrent que la méthode automatisée proposée est capable de récapitulant les résultats d’études antérieures. Ce qui est important, le perinexus est une structure définie récemment et aucun consensus ne s’est dégagé sur la gamme des valeurs absolues de séparation par membrane adjacente au GJ2,3. Étant donné que la largeur GJ externe-membrane-à-membrane externe a été précédemment estimé à 20 nm13, nous avons cherché à déterminer l’efficacité de l’algorithme de mesurer également la largeur de GJ. Les deux observateurs observés aucune différence significative entre les largeurs de jonction gap (GJW) des patients avec ou sans AF préexistante (Figure 9B). Valeurs absolues de GJW pour AF et les patients non-AF étaient de 20,5 ± 2,5 nm et 20,3 ± 1,9 nm, respectivement pour l’observateur expérimenté et 21.0 ± 3,1 nm et 20.0 ± 2,2 nm pour l’observateur inexpérimenté, semblable à ce qui a été rapporté précédemment. Pour déterminer si l’algorithme automatisé tenu moins de temps pour analyser les données que la segmentation manuelle, aussi bien l’utilisateur expérimenté et inexpérimenté ont enregistré le temps nécessaire pour quantifier une formation 10-image définie (fichier supplémentaires S5). Le tableau 1 montre que l’utilisateur expérimenté et inexpérimenté ont diminué temps d’analyse de 4,7 et 8.3 fois respectivement en utilisant l’algorithme automatisé par rapport à l’approche de la segmentation manuelle, avec une augmentation environ 43-fold spatiale résolution le long de la perinexus. Algorithme de dépannage. L’erreur la plus fréquente lors de l’exécution de l’algorithme se produit lorsque l’axe final ne s’arrête pas au bord de l’image. Dans ce cas, pas assez de points ont été tirés de la carte spatiale de la dérivée, causant le programme en panne et de produire un message d’erreur indiquant l’utilisateur de sélectionner une plus grande surface de récolte ou augmenter le seuil dérivé spatial. Dessin d’une plus grande boîte de culture améliorera la fiabilité du programme dans certains cas comme les changements spatiaux dérivés radicalement près des bords de la figure, qui peuvent perturber les algorithmes de détection de pathfinding ou bord. Il est également possible pour l’algorithme de pathfinding ne parviennent pas à identifier correctement la ligne médiane, même si l’axe arrive au bord de l’image, particulièrement si le seuil de gradient est trop basse (Figure 2A). Si le seuil de gradient est réglé trop haut, il y aura plus de points inutiles incorporés dans l’algorithme de pathfinding (Figure 2B), diminuant l’efficacité computationnelle. Si l’utilisateur est incapable de déterminer un seuil approprié, le tableau de l’image “GMag » (Figure 2C), qui est généré par le programme et se trouve dans l’espace de travail, peut aider l’utilisateur déterminer le seuil. Trouvez les points le long de la ligne médiane et régler le seuil légèrement au-dessus de leur valeur d’Index pour assurer que ces points sont choisis. Dans l’exemple donné, un seuil approprié serait au-dessus de ~5.1 (Figure 2C, insérer). Le point de départ peut également échouer atteindre le début de le perinexus (Figure 2D). Dans ce cas, ré-exécuter le programme et affectez la valeur de Démarrage manuel 1. Après que l’axe a été isolé, l’utilisateur sélectionne un point situé en dehors de la perinexus et le point d’axe le plus proche de pixel sélectionné (Figure 2E, la place rouge) sera défini comme le point de départ. Le résultat est l’axe plein (Figure 2F). Figure 1 : Images TEM avec processus de quantification. Le processus de segmentation manuelle (A) oblige l’utilisateur à effectuer des 12 mesures intermembranaire individuels tout en estimant l’axe central. Le processus automatique (B) exige une trace manuelle, continue, de l’esquisse de la perinexus. Le point rouge dans chaque image représente la fin utilisateur-identifié de la GJ et le début de la perinexus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.  Figure 2 : Axe dépannage. Deux modes principaux d’échec pour l’identification de la ligne médiane et leurs solutions : chaque image est étiqueté avec le nom du tableau dans Matlab. Si le seuil de gradient est trop faible (A, seuil 0,2), l’algorithme d’axe peut échouer. Réglage du seuil trop élevé (B, seuil 70) peut réduire l’efficacité computationnelle de l’algorithme de pathfinding. Un seuil approprié de gradient peut être déterminé par le tableau de GMag (C, insérer). Si l’axe n’ont pas atteint le bord de début de la perinexus (D), l’utilisateur peut choisir de sélectionner manuellement le point de départ. Après le « Point de commencer » option est définie sur 1 dans le GUI de l’ouverture, l’utilisateur, puis sélectionne un point en dehors de la perinexus d’intérêt (E). Le résultat final devrait être un axe central qui représente avec précision la totalité de la perinexus (F). Toutes les étiquettes en citations (A-F) correspondent aux noms de variable dans Matlab. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Sélection de Perinexus. Pour rogner le perinexus, cliquez et maintenez pour faire glisser une boîte autour d’elle (l’outil de recadrage est sélectionnée automatiquement) comme indiqué par la flèche bleue. Cette boîte peut être ajustée en utilisant les carrés sur les côtés et les coins pour le rendre plus grand ou plus petit. La flèche verte représente la fin de la perinexus, dont l’utilisateur doit s’assurer reste « ouverte ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Dilatations série image. Le plan binaire est à plusieurs reprises dilaté par incréments d’un pixel (A-D) et ajouté à l’image de travail (forme non binaire de l’image, E-H) après chaque dilatation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5: pathfinding et l’isolement de la ligne médiane. Un dérivé spatial est calculé à partir de l’image finale du travail (A) et l’ampleur de cette dérivée spatiale (B) est utilisée pour isoler le contour et le trait d’axe (flèches blanches). Un seuil défini par l’utilisateur identifie les grandes lignes et l’axe central et en soustrayant l’esquisse originale donne l’axe (D). Toutefois, les lacunes apparaissent dans l’axe à la suite du seuil (D – insérer). Afin de produire une ligne de construction continue, une dilatation secondaire est effectuée sur l’axe isolé (E), suivie d’une érosion secondaire pour accroître l’efficacité de calcul d’un algorithme de pathfinding ultérieures. Cette image érodée (F) se combine alors avec l’image finale du travail, ce qui permet d’identifier un axe continu, un pixel d’épaisseur (G – insérer). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Présentation de données final. Le programme des sorties du contour final sur le dessus de l’image originale de TEM (A). La ligne est de couleur verte pour 0-150 nm, bleu pour la région définie par l’utilisateur de l’intérêt et le rouge pour la zone au-delà de 150 nm. En outre, le programme génère un graphique de même couleur représentant Wp en fonction de la distance entre le début de la perinexus et pour la région d’intérêt (B), ainsi que la moyenne Wp (médaillon graphique respectifs). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Analyse de la forme du noyau dilatation. Formes pour les noyaux de dilatation (A) : l’étoile au milieu représente les pixels dilatées. Boîtes blanches sont touchés par la dilatation, sous la forme d’un plus, X, boîte ou ligne de pixels. Un perinexus environ horizontal (B, haut, avec une ligne rouge indiquant 0°) a été tourné vers la droite de 0 à 180° par pas de 10° et dilatée à plusieurs reprises en utilisant les formes de noyau différent (B, en bas). Plus et ligne-en forme de grains donnent des résultats similaires, bien que le noyau de la ligne échoue à certaines orientations, alors que les noyaux et X-en forme de boîte sont déphasées de 45 °. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Correction de l’Orientation de l’image. À correct pour l’orientation de l’image, la pente moyenne de la perinexus est calculée à partir des positions du début – et end – points (A, à gauche, début et fin de ligne noire). La tangente inverse de la variation de l’axe y (une, ligne de gauche, verte) divisé par le changement du rendement de la direction x (A, gauche, la ligne rouge) l’angle de correction, θ (A, gauche, jaune). Le but est de corriger ensuite la valeur dep W moyenne pour donner la distance minimale entre les bords, comme si le perinexus avait été photographié environ horizontalement (A, ci-dessous à gauche). L’application du facteur de correction décrite par l’équation 1 a été comparée à tourner manuellement chacune des 15 images choisies au hasard par le θ calculée avant l’analyse. Les valeurs corrigées fortement corrélés avec les valeurs de rotation-image (R2 = 0,991, A, droite), indiquant que l’équation 1 est un facteur de correction valable pour l’orientation de l’image. Pour confirmer que le facteur de correction est approprié, deux fantômes ont généré des bords parfaitement parallèles avec une distance connue entre eux (B, à gauche). Phantom 1 et 2 de Phantom ont une résolution spatiale de 2,833 pixels / mm et 71,6 pixels/pouce, respectivement. Comme en témoigne les diamants bleus et les carrés rouges en B, droite, l’algorithme avec précision calcule leurs largeurs dans 180 degrés de rotation de l’image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 9 : Reproductibilité algorithme. En utilisant le processus automatique avec correction de l’orientation d’image, un observateur à la fois expérimenté et inexpérimenté trouvé des différences significatives entre AF et non-AF groupes (A), conformes à une précédente étude, détecter une différence minimale de 2,6 nm. En outre, aucun observateur a trouvé une différence significative dans la GJW (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Manuelle Automatique Temps – Obs. 1 (s) 205±11 44±14 Temps – Obs. 2 (s) 248±18 30±5 Résolution spatiale (mesures/nm) 0,08 3.45 Tableau 1 : comparaison des processus manuels et automatiques de. Les deux observateurs exigé moins de temps par image pour tracer le contour qu’afin effectuer le processus de segmentation manuelle pour un ensemble de formation image-10. En outre, le processus automatique dispose d’une plus grande fréquence d’échantillonnage, enregistrement des 3,45 mesures / nm, comparée à une moyenne de 1 mesure chaque 12,5 nm pour le processus manuel. Les images de set formation trouvera dans S5 de fichier supplémentaire, ainsi que les contours et les mesures interprété par un utilisateur expérimenté.