Kwantificeren van de Intermembrane afstanden met seriële afbeelding Dilations

Statistische methoden: Er werden vergelijkingen gemaakt tussen experimentele groepen met behulp van de Student t-tests. Een p-waarde < 0,05 significant wordt beschouwd en alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking. Handmatige segmentatie. De kwantificering van de GJ-aangrenzende perinexus nanodomain breedte (Wp) wordt meestal bereikt door handmatige segmentatie. Deze segmentering van de handmatige proces wordt geïllustreerd in Figuur 1A en was eerder6beschreven. De waarnemer identificeert de rand van de GJ (afbeelding 1, rode stip), maatregelen 5nm langs het centrum van de perinexus, en de afstand tussen de membranen op dat moment. Het proces wordt dan herhaald op 10, 15, 30 en elke 15 nm tot 150 nm. Deze techniek, terwijl het effectief, heeft beperkingen van tijd en ruimtelijke onder bemonstering langs de lengte van de perinexus. Bedoel Wp metingen uit eerdere studies kunnen variëren van ongeveer 10 tot 20 nm2,-3,10, en 3 nm lijkt te zijn het gemiddelde verschil die nodig zijn voor het detecteren van statistische significantie, die ruim boven de ruimtelijke Nyquist-frequentie van 0,7 nm per meting op basis van de resolutie van een interpixel van 0,34 nm. Daarom, terwijl handmatige segmentatie tijdrovend is, de methode is voldoende om het meten van verschillen in Wp gekoppeld van de status van een interventie of ziekte. Seriële Image Dilations. Om te meten de perinexus op een snellere, reproduceerbare wijze met passende ruimtelijke resolutie, ontwikkelden we een programma gebaseerd op seriële afbeelding dilations rekenen de pixels tussen twee handmatig getraceerd membranen, die kunnen worden gezien in Figuur 1B . De seriële dilatatie-proces wordt geïllustreerd in Figuur 4. Als de binaire image is uitgezet (figuur 4A-4D), dat dilatatie vervolgens wordt omgekeerd en toegevoegd aan de afbeelding van een werken – de niet-binaire vorm van de oorspronkelijke omtrek (figuur 4E-4 H). Het proces wordt herhaald totdat de omtrek is volledig ingevuld (Figuur 4D). Op dit punt, is het eindbeeld werken (Figuur 4H) een telling van het aantal keren dat een bepaalde pixel door de VN verwijde gebleven. Als zodanig, zijn de waarden in de buurt van de omtrek van de celmembranen erg laag, terwijl de waarden in het midden hoogste zijn. Door het tellen van het aantal dilations te vullen van het gebied op elk punt, kan de afstand tussen de randen van het membraan worden berekend. De volgende uitdaging is het identificeren en isoleren van de middellijn om te kwantificeren perinexal breedte als een functie van de afstand van de GJ, die wordt gedaan door een ruimtelijke afgeleide eerste op het eindbeeld van de werken te passen (Figuur 2-laatste afbeelding en Figuur 5 A). Een tweede voorbeeld van een meer onregelmatig gevormde perinexus kan worden gevonden in aanvullende bestand S3. Identificatie van de middellijn. Het verloop van het uiteindelijke beeld van de werken kan worden gekwantificeerd door een ruimtelijke derivaat, als graaf van de dilatatie waarden van rand tot rand van hoog naar laag naar hoog opnieuw wijzigen (Figuur 5A van links naar rechts). Gezien alleen de omvang van de ruimtelijke afgeleide (Figuur 5B) zijn het overzicht en de middellijn, gemarkeerd met witte pijlen als gebieden van discontinuïteit onmiddellijk herkenbaar. Op deze locaties verandert de kleurovergang richting van vergroten om te minderen of vice versa. Toepassing van een drempel (Figuur 5C) produceert een binaire beeld van de middellijn en omtrek, en af te trekken van de oorspronkelijke omtrek levert de geïsoleerde middellijn (Figuur 5D). Hoewel deze methode van isoleren de middellijn computationeel efficiënt is, maakt de drempel die is toegepast op de ruimtelijke afgeleide hiaten in de resulterende middellijn. Deze lacunes (Figuur 5D, insert) moeten worden gevuld om een nauwkeurige meting van de afstand van de GJ en om ervoor te zorgen dat de perinexus wordt gemeten in zijn geheel. Eerst, de middellijn is uitgezet om te vullen in eventuele leemten (Figuur 5E), gevolgd door een erosie (Figuur 5F) en een “bwmorph”-functie (operatie = ‘skel’, n = inf) te elimineren zo veel punten als mogelijk terwijl een continu middellijn, waardoor de computationele efficiëntie van een latere vastloper algoritme ontwikkeld door Wasit Limprasert en beschikbaar op centrale MATLAB9. Deze functie dilatatie-erosie produceert de voltooide middellijn, die wordt gecombineerd met het eindbeeld werken (Figuur 5G). Echter, deze middenlijnoverlappingen is vaak meer dan één pixel dik en is daarom niet een nauwkeurige isolatie van de middellijn. De Wasit Limprasert vastloper algoritme wordt gebruikt om te bepalen van de middellijn van de perinexus. De vastloper algoritme vermag de hoogste waarden – in dit geval de waarden die zich het dichtst bij het centrum die bleef un-verwijde via de meest iteraties langs de middellijn (Figuur 5G, insert) bijhouden. Het resultaat is een automatische spoor van de middellijn, zoals aangegeven in Figuur 6. Door het isoleren van de middellijn, kan perinexal breedte worden gepresenteerd als een functie van de afstand vanaf het einde van de GJ, zoals aangegeven in Figuur 6B (boven), of als de gemiddelde breedte van een bepaald gebied van belang. Kernel analyse. Het is belangrijk op te merken dat de gedigitaliseerde afbeeldingen zijn op basis van vierkante matrices en dilatatie kernels zijn eveneens gebaseerd op vierkante matrices. Dit betekent dat dilatatie afstand over een diagonaal groter dan orthogonale is. Daarom wilden we volgende bepalen of de kernel beïnvloed de resultaten van het algoritme. Om te kwantificeren kernel-specifieke variabiliteit, vijf verschillende kernel vormen werden geanalyseerd: “Plus” (de vorm die wordt gebruikt in de bovenstaande analyses), “X”, “vak” en “Line”, zoals beschreven in Figuur 7A. De kernel wordt toegepast op elke niet-nulzijnde punt in een binaire afbeelding. De ster in elke kernel van Figuur 7A vertegenwoordigt het centrum, waar de witte is een waarde van 1, en zwart is een waarde van 0 voor de dilatatie-kernel. Elke kernel van invloed op de gemiddelde Wp meting van een enkel ongeveer horizontale perinexal beeld (Figuur 7B, bovenaan), gekwantificeerd door een ervaren gebruiker, werd bepaald door het roteren van de afbeelding met Matlab van “imrotate” commando en Computing Wp in stappen van 10 °. De Wp meetwaarden (Figuur 7B, bodem) schommelen met de afdrukstand van de afbeelding in een gerectificeerde sinusvormige mode met een Plus vormige kernel. De laagste waarden voorkomen wanneer een relatief rechte perinexus georiënteerde verticaal of horizontaal. De X, vak, noch lijn kernels verstrekt een voordeel ten opzichte van de plus-vormige kernel. De X – en vak kernels identieke resultaten opgeleverd, maar de waarden van betekenen Wp waren uit fase met the Plus kernel door 45 °. De lijn -kernel niet volledig het verwijden van de afbeelding in een bepaalde hoek zoals kan worden gezien door het ontbreken van gegevens in het groene spoor voor afbeeldingen gedraaid van minder dan 30 of meer dan 145 °. Dus, de orthogonale Plus dilatatie kernel overschat membraan scheiding als een perinexus met een as leerstoornissen diagonaal bijvoorbeeld bij ongeveer 45 georiënteerde °, en de X – en vak kernels gemiddelde Wonderschat p toen de lengteas van de perinexus ook bij 45°. Op basis van deze analyse, ontwikkelden we een correctiefactor toegepast op de waarden die zijn gegenereerd op basis van leerstoornissen met de plus-vormige kernel. Ter verantwoording voor de overschatting van de membraan scheiding die is gekoppeld aan de afdrukstand van de afbeelding, deze correctiefactor vermenigvuldigd met de breedtewaarde van de gemeten afhankelijk van de afdrukstand van de afbeelding (vergelijking 1). Als θ < 45°      Wp gecorrigeerd cosd(θ) = * Wp gemeten Als θ ≥45 °      Wp gecorrigeerd cosd(θ) = * Wp gemeten (vergelijking 1) In deze vergelijking is Wp gemeten de oorspronkelijke Wp waarde gegenereerd door het bovenstaande algoritme en θ de berekende hoek van horizontaal, in graden. Θ wordt berekend door het nemen van de inverse tangens van de totale verandering in horizontale richting gedeeld door de totale verandering van de verticale richting van de middellijn van de perinexal. De bovenstaande correctie benadert de gemiddelde hoek, ten opzichte van horizontaal, van de perinexus (Figuur 8A, links-boven) en resulteert in een meting alsof verkregen van een horizontale perinexus (Figuur 8A, links beneden). De grondgedachte achter deze vergelijking komt van het feit dat de plus-vormige kernel (Figuur 7A) in wezen twee lijn-vormige kernels gerangschikt orthogonaal met elkaar zijn verbonden is. Als zodanig onder 45° (dichter bij horizontale), de dilations verticaal optreden en daarom te vermenigvuldigen met de cosinus van de hoek geeft de correcte meting. Daarentegen voor hoeken boven 45° (dichter bij verticale), dilations optreden horizontaal en de sinus is gebruikt om te bepalen van de correcte meting. Precies 45 ° zijn de sinus en cosinus gelijk. Aanvullende bestand S4 bevat een afbeelding van dit concept. Merk op dat deze correctie is gebaseerd op de gemiddelde hoek en voorzichtigheid moet worden gebruikt bij de analyse van wezenlijk niet-lineaire vormen. Dit proces werd herhaald op 20 willekeurig geselecteerde perinexi en de gecorrigeerde metingen sterk gecorreleerd met metingen verkregen door handmatig draaien en opnieuw het analyseren van de beelden (Figuur 8A, rechts). Om te bevestigen de nauwkeurige correctie voor afdrukstand, waren twee sets van phantom randen gegenereerde (Figuur 8B, links) en 180 ° gedraaid. Met de trigonometrische correctie keerde het algoritme nauwkeurig de juiste waarde op elke geaardheid, ongeacht de ruimtelijke resolutie of de grootte van de afbeelding (Figuur 8B, rechts). Analytische toepassing en reproduceerbaarheid met oriëntatie correctie. Eraan herinnerend dat eerdere studies met behulp van handmatige segmentatie verslag statistisch significant bedoel Wp verschillen groter is dan of gelijk aan 3 nm, was het belangrijk om te bepalen of het algoritme kan worden gebruikt voor recapituleren eerdere bevindingen met behulp van een volledige dataset. Met behulp van de nieuwe algoritme, twee waarnemers – ervaren en onervaren met perinexal analyse (Obs. 1en Obs. 2, respectievelijk)-dezelfde afbeeldingen van een eerdere studie6 die opgenomen van 12 patiënten die werden gediagnosticeerd met atriale geanalyseerd fibrillatie (AF) voorafgaand aan weefsel collectie en 29 patiënten die geen bestaande AF (No-AF). De ervaren gebruiker gevonden dat Wp was aanzienlijk breder in patiënten met AF dan zonder AF (21.9±2.5 en 18.4±2.0 nm, respectievelijk, Figuur 9A). Deze waarden met de correctiefactor toegepast zijn vergelijkbaar met die gemeld eerder (24.4±2.2 nm en 20.7±2.4 nm, respectievelijk)6. Nog belangrijker is, de onervaren gebruiker hetzelfde significant verschil gevonden (22.1±2.8 nm en 20.1±2.6 nm, respectievelijk) tussen ziekte staten met de geautomatiseerde programma. Bovendien, veranderde de standaarddeviatie van de waarden Wp niet met de correctiefactor, die aangeeft dat de standaarddeviatie van 2-3 nm is niet een artefact van het algoritme, maar de structuur zelf en verwerking van het weefsel. Deze resultaten tonen aan dat de voorgestelde geautomatiseerde methode staat de resultaten van eerdere studies Recapitulerend is. Nog belangrijker is, de perinexus is een recent gedefinieerde structuur en geen consensus heeft bereikt zijn op het bereik van absolute waarden van membraan scheiding grenzend aan de GJ2,3. Aangezien-membraan-naar-buitenste-buitenmembraan GJ breedte is eerder geraamd op 20 nm13, wij gestreefd naar het bepalen van het algoritme werkzaamheid door GJ breedte ook te meten. Beide waarnemers vond geen significant verschil tussen gap junction breedtes (GSW) van patiënten met of zonder vooraf bestaande AF (Figuur 9B). Absolute GSW waarden voor AF- en niet-AF patiënten waren 20.5 ± 2,5 nm en 20.3 ± 1.9 nm, respectievelijk voor de ervaren waarnemer en 21.0 ± 3.1 nm en 20,0 ± 2.2 nm voor de onervaren waarnemer, vergelijkbaar met wat eerder is gemeld. Om te bepalen of de geautomatiseerde algoritme vereist minder tijd om gegevens dan handmatig segmentatie te analyseren, zowel de ervaren en onervaren gebruiker opgenomen de tijd die nodig is te kwantificeren van een training van 10-afbeelding instellen (aanvullende bestand S5). Tabel 1 toont aan dat de ervaren en onervaren gebruiker analyse tijd door 4,7 daalde- en 8.3 keer respectievelijk het gebruik van de geautomatiseerde algorithm ten opzichte van de handmatige segmentatie benadering, met ongeveer 43-fold toename van ruimtelijke resolutie langs de perinexus. Algoritme oplossen. De meest voorkomende fout bij het uitvoeren van het algoritme treedt op wanneer de laatste middellijn niet aan de rand van de afbeelding eindigt. In dergelijke gevallen werden niet genoeg punten geselecteerd uit de ruimtelijke afgeleide kaart, waardoor het programma te mislukken en een foutbericht weergegeven, waarbij de gebruiker selecteren een grotere snijgebied of verhoging van de ruimtelijke afgeleide drempel produceren. Tekenen van een grotere uitsnijdvak zal verbeteren de betrouwbaarheid van het programma in sommige gevallen als de ruimtelijke afgeleide verandert drastisch in de buurt van de randen van de figuur, die de vastloper of rand detectie-algoritmen kunnen verstoren. Het is ook mogelijk voor de vastloper algoritme te mislukken voor een correcte identificatie de middellijn, zelfs als de middellijn bereikt de rand van het beeld, met name als de kleurovergang drempel is te laag(Figuur 2). Als de kleurovergang drempel is te hoog ingesteld, zal er meer overbodige punten opgenomen in de vastloper algoritme (Figuur 2,B), afnemende computationele efficiëntie. Als de gebruiker niet in staat om te bepalen van een passende drempel, de afbeelding array is “GMag” (Figuur 2C), die wordt gegenereerd door het programma en kan worden gevonden in de werkruimte kunt helpen de gebruiker bepalen de drempel. Het vinden van punten langs de middellijn en stel de drempel iets boven hun indexwaarde om ervoor te zorgen dat deze punten worden geselecteerd. In het gegeven voorbeeld zou een passende drempel boven ~5.1 (Figuur 2C, insert). Het beginpunt kan ook mislukken tot het begin van de perinexus (Figuur 2D). In dit geval opnieuw uitvoeren van het programma en de Handleiding Start waarde ingesteld op 1. Nadat de middellijn geïsoleerd is, de gebruiker selecteert een punt buiten de perinexus en de middellijn punt dat zich het dichtst bij de geselecteerde pixel (Figuur 2E, Rode plein) zal worden ingesteld als het beginpunt. Het resultaat is de volledige middellijn (Figuur 2F). Figuur 1 : TEM beelden met kwantificering processen. De segmentering van de handmatige proces (A) moet de gebruiker metingen uit te voeren 12 individuele intermembrane terwijl het schatten van de middellijn. Het automatische proces (B) vereist een handmatige, continue spoor van de omtrek van de perinexus. De rode stip in elke afbeelding vertegenwoordigt het eind gebruiker-aangeduid van de GJ en het begin van de perinexus. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.  Figuur 2 : Oplossen van problemen met middellijn. Twee primaire wijzen van mislukking voor de identificatie van de middellijn en hun oplossingen: elke afbeelding is geëtiketteerd met de naam van de matrix in Matlab. De kleurovergang drempel is te laag (A, drempel 0.2) de middellijn algoritme kan mislukken. Instellen van de drempel te hoog (B, drempel 70) de computationele efficiëntie van het algoritme van de vastloper kan verminderen. Een juiste gradiënt drempel kan worden bepaald uit de matrix van GMag (C, invoegen). Als de middellijn niet tot de rand van het begin van de perinexus (D), kan de gebruiker kiezen om handmatig selecteren het beginpunt. Na de “Start Point” optie is ingesteld op 1 in de opening GUI, de gebruiker en selecteert dan een punt buiten de perinexus van belang (E). Het eindresultaat moet een middellijn die nauwkeurig het geheel van de perinexus (F verbeeldt). Alle etiketten in citaten (A-F) komen overeen met de namen van de variabelen in Matlab. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3 : Perinexus selectie. Bijsnijden van de perinexus, click-and-hold te Sleep een vak rond het (het gereedschap Uitsnijden is automatisch geselecteerd) zoals aangegeven door de blauwe pijl. Dit vak kan worden aangepast met behulp van de vierkantjes aan de zijkanten en hoeken groter of kleiner te maken. De groene pijl geeft het einde van de perinexus, zodat de gebruiker blijft “open.” Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4 : Seriële afbeelding dilations. De binaire omtrek is herhaaldelijk uitgezet in stappen van één pixel (A-D) en toegevoegd aan het beeld van de werken (de niet-binaire vorm van het beeld, de E-H) na elke dilatatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: middellijn isolatie en vastloper. Een ruimtelijke derivaat is berekend op basis van het uiteindelijke beeld van de werken (A) en de omvang van die ruimtelijke afgeleide (B) wordt gebruikt voor het isoleren van de omtrek en de middellijn (witte pijlen). Een door de gebruiker gedefinieerde drempel identificeert de omtrek en middellijn en aftrekken van de oorspronkelijke omtrek levert de middellijn (D). Echter de hiaten in de middellijn ten gevolge van de drempel (D – invoegen). Om een continue middellijn, wordt een secundaire dilatatie uitgevoerd op de geïsoleerde middellijn (E), gevolgd door een secundaire erosie de computationele efficiëntie van een latere vastloper algoritme te verhogen. Deze geërodeerde afbeelding (F) wordt dan gecombineerd met het eindbeeld van werken, waardoor voor de identificatie van een continue, one-pixel-dikke middellijn (G – invoegen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6 : Laatste gegevenspresentatie. Het programma uitgangen de definitieve omtrek op de top van de oorspronkelijke afbeelding TEM (A). De lijn is kleurcode groen voor 0-150 nm, blauw voor de gebruiker gedefinieerde regio van belang en rood voor het gebied dan 150 nm. Bovendien is het programma uitgangen een evenzo gekleurde grafiek vertegenwoordigen Wp als een functie van de afstand vanaf het begin van de perinexus en voor de regio van belang (B), evenals de gemiddelde Wp (inzet in de respectieve grafiek). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7 : Dilatatie kernel vorm analyse. Shapes voor dilatatie kernels (A): de ster in het midden vertegenwoordigt de verwijde pixels. Witte dozen zijn pixels die zijn beïnvloed door de dilatatie, in de vorm van een plus, X, vak of lijn. Een ongeveer horizontale perinexus (B, boven, met een rode streep geeft 0°) was met de klok mee gedraaid van 0 tot 180° in stappen van 10° en herhaaldelijk verwijde met behulp van de shapes van de verschillende kernel (B, bodem). Plus – en lijn-vormige kernels vergelijkbare resultaten opleveren, hoewel de regel kernel op bepaalde richtsnoeren, mislukt terwijl de vak – en X-vormige kernels uit fase van 45 °. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 8 : Image oriëntatie correctie. Om juiste voor de oriëntatie van het beeld, de gemiddelde hoek van de perinexus is berekend op basis van de standpunten van de begin – en einde – points (A, verliet begin en einde van de zwarte lijn). De inverse tangens van de verandering in de y-richting (A, links, groene lijn) gedeeld door de wijziging in de x-richting (A, links, rode lijn) opbrengsten de correctie hoek, θ (A, links, geel). Het doel is om corrigeer vervolgens de gemiddelde Wp -waarde geven de minimale afstand tussen de randen, alsof de perinexus had ongeveer horizontaal is beeld (A, links hieronder). De toepassing van de correctiefactor beschreven door vergelijking 1 was ten opzichte van handmatig draaien elk van de 15 willekeurig geselecteerde beelden door de berekende θ vóór de analyse. De gecorrigeerde waarden sterk gecorreleerd met de gedraaid-image waarden (R2 = 0.991, A, rechts), die vergelijking 1 aangeeft is een geldige correctiefactor voor afdrukstand van afbeelding. Om te bevestigen dat de correctiefactor is geschikt, werden twee spoken gegenereerd van perfect-parallel randen met een bekende afstand tussen hen (B, links). Phantom 1 en Phantom 2 hebben een ruimtelijke resolutie van 2.833 pixels / mm. en 71.6 pixels/in., respectievelijk. Zoals door de blauwe diamanten en rode vierkantjes in B, recht, berekent het algoritme nauwkeurig u hun breedte over Beeldrotatie 180 graden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 9 : Algoritme reproduceerbaarheid. Met behulp van het automatische proces met image oriëntatie correctie, zowel ervaren en onervaren waarnemer vonden significante verschillen tussen AF- en No-AF groepen (A), consistent met een eerdere studie, opsporen van een minimum verschil van 2.6 nm. Bovendien, noch waarnemer gevonden een significant verschil in GSW (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Handmatig Automatisch Tijd – Obs. 1 (s) 205±11 44±14 Tijd – Obs. 2 (s) 248±18 30±5 Ruimtelijke resolutie (metingen/nm) 0.08 3.45 Tabel 1: vergelijking van handmatige en automatische processen. Beide waarnemers vereist minder tijd per beeld om te traceren van de omtrek dan uitvoeren om de segmentering van de handmatige proces voor een 10-image opleiding ingesteld. Bovendien, het automatische proces heeft een hogere bemonsteringsfrequentie, opname van 3,45 metingen per nm, in vergelijking met een gemiddelde van 1 meting elke 12,5 nm voor het handmatige proces. De opleiding set beelden kunnen worden gevonden in aanvullende bestand S5, samen met contouren en metingen zoals uitgevoerd door een ervaren gebruiker.