JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Published: November 09, 2018
doi:
10.3791/58310
, , ,
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women’s Guild Lung Institute,Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences,Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute,Cedars-Sinai Medical Center

Summary

Burada, iki hücre dışı vezikül yalıtım protokol, Ultrafiltrasyon Santrifüjü ve ultrasantrifüj ile yoğunluk gradient Santrifüjü ekstraselüler veziküller fare bronchoalveolar lavaj sıvı örneklerinden izole etmek, açıklamak. Fare bronchoalveolar lavaj sıvı her iki yöntem tarafından türetilmiş hücre dışı veziküller sayılabilir ve karakterize.

Abstract

Hücre dışı veziküller (EVs) birçok biyolojik işlevleri fizyolojik ve patolojik durumları sırasında sinyal önemli rol oynamaktadır yeni keşfedilen hücre altı bileşenleridir. EVs yalıtım her tekniği için iç kısıtlamaları nedeniyle bu alanda büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Yoğunluk gradient Santrifüjü yöntemi ile fark ultrasantrifüj yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır ve EV yalıtım için altın standart prosedür olarak kabul edilir. Ancak, bu yordam zaman alan, emek yoğun ve genellikle küçük hacimli örnekleri bronchoalveolar lavaj sıvı gibi için uygun olmayabilir düşük ölçeklenebilirlik sonuçlanır. Biz bir Ultrafiltrasyon Santrifüjü yalıtım yöntemi basit ve zaman ve emek verimli henüz bir yüksek kurtarma verim ve saflık sağlar göstermek. Önerdiğimiz bu yalıtım yöntemini EV yalıtımı, küçük hacimli biyolojik örnekler için özellikle uygun olan alternatif bir yaklaşım olabilir.

Introduction

Exosomes EVs, 50-200 nm çapında, en küçük alt kümesini ve işlemleri1,2,3,4,5sinyal çeşitli bir dizi birden çok biyolojik işlevleri yoktur. Öncelikle kargo moleküller gibi yağlar, proteinler ve nükleik asitler6,7,8,9 aracılığıyla hücreler arası iletişim kolaylaştırarak cep ve doku homeostazı yöneten . Bir kritik adım EV araştırma yalıtım işlemidir. Fark ultrasantrifüj (UC), ile ya da ezelî yoğunluk gradient Santrifüjü (DGC), altın standart yaklaşım olarak kabul edilmektedir, ancak bu yöntem verimsiz EV kurtarma oranları ve düşük ölçeklenebilirlik10 da dahil olmak üzere büyük sınırlamalar taşır , 11 , 12, bu hücre kültür süpernatant veya yüksek eksozom üretim örnekleri gibi daha büyük ses örnekleri kendi en iyi kullanımı kısıtlamak. Avantajları ve dezavantajları boyutu dışlama Ultrafiltrasyon veya kromatografi, immunoaffinity yalıtım boncuk veya sütun ve havacilik, tarafından gibi diğer yöntemlerini de açıklanmıştır ve modern ek prosedür için geliştirilmiştir üstesinden gelmek ve her yaklaşım11,12,13,14,15dakika sonra teknik sınırlamalar en aza indirmek. Diğerleri nanoporous membran filtre birimi ile Ultrafiltrasyon Santrifüjü (UFC) UC yöntemi16,17,18karşılaştırılabilir saflık sağlar alternatif bir teknik olduğunu göstermiştir. Bu teknik bir alternatif izolasyon yöntemleri olarak düşünülebilir.

Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) çok sayıda Biyolojik işlevleri çeşitli solunum koşulları19,20,21,22sahip EVs içerir. BALF türetilmiş EVs gerektirdiği bazı zorluklar nedeniyle insanlar bronkoskopi yordamda yanı sıra lavaj sıvı kurtarma sınırlı bir miktarda invasiveness okuyor. Hayvanlarda küçük laboratuvar fareler gibi sadece bir kaç mililitre normal akciğer koşullarında elde edilebilir, iltihaplı veya fibrotik akciğerler23yılında daha az bile. Sonuç olarak, karşıdan akış uygulamaları için bir fark ultrasantrifüj tarafından BALF yeterli miktarda EV yalıtım için toplama mümkün olmayabilir. Ancak, doğru EV nüfus yalıtma EV biyolojik fonksiyonlar çalışmak için çok önemli bir faktördür. Verimliliği ve etkinliği arasındaki hassas dengeyi köklü EV yalıtım yöntemleri bir sorun olmaya devam etmektedir.

Bu çalışmada bir 100 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) nanomembrane filtre ünitesi, kullanan bir santrifüj Ultrafiltrasyon yaklaşım BALF gibi küçük hacimli biyolojik örnek için uygun olduğunu göstermektedir. Bu teknik basit, etkili ve yüksek saflıkta ve BALF elde edilen EVs çalışma desteklemek için ölçeklenebilirlik sağlar.

Protocol

Hayvanlar kullanımı ve tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Cedars-Sinai Tıp Merkezi (CSMC) tarafından kabul edildi. 1. fare Bronchoalveolar lavaj sıvısı (BALF) toplama ve hazırlık BALF koleksiyonu Ketamin (300 mg/kg) ve xylazine (30 mg/kg) servikal çıkığı tarafından takip mayi rota üzerinden bir kokteyl ile fareler ötenazi. 22 G angiocatheter nefes borusu yerleştirin. 1 mL (mL) buz gibi steril Dulbecco’n…

Representative Results

Fare BALF EV yalıtım gerçekleştirilen aynı gün UFC ve UC-DGC izolasyon yöntemleri kullanarak. UC-DGC tekniği, uzun işlem süresi 8 h gerekli ise UFC yöntemi yaklaşık 2,5-3 h, gerekli. Bu arabellekleri ve reaktif hazırlama süresi içermiyordu. Bu bazı diğer görevler uzun aralıklarla dönemlerde yerine olabilir unutulmamalıdır. Yine de, Bütün prosedür UC-DGC yalıtım tekniği için neredeyse bir gün sürdü. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="…

Discussion

Son birkaç on yıl içinde bilim adamları EVs anlamlar içinde hücresel homeostazı sökülmüş. Daha da önemlisi, EVs önemli rolleri birçok hastalığı süreçlerinde onların biyoaktif kargo molekülleri1,21,22,26,27 ile komşu ve uzak hücreleri oransal olarak oynamak , 28 , 29 <s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

İş NHLBI/NIH hibe HL103868 (PC) ve HL137076 (PC için) Amerikan Kalp Derneği Grant-in-Aid (PC için) ve Samuel Oschin kapsamlı Kanser Enstitüsü (SOCCI) akciğer kanser araştırma Ödülü (için PC) tarafından desteklenmektedir. Smidt Kalp Enstitüsü Nanosight makine EV nanopartikül izleme çözümlemesi için bize sağlar Cedars-Sinai Tıp Merkezi için bizim büyük takdir ifade etmek istiyorum.

Materials

Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany –
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA –
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK – To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany –
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA –
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Tags

Extracellular VesiclesBronchoalveolar Lavage FluidUltrafiltration CentrifugationUltracentrifugationDensity Gradient PurificationMurineTracheaDPBSSupernatantSyringe FilterCentrifugal Filter UnitRetentateAliquot

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image