Aislamiento y la descelularización de un páncreas todo porcino
Summary
Ingeniería de tejidos del páncreas entero es un desafío debido a sus funciones exocrinas y endocrinas. Mostramos un método para la disección de un páncreas porcino intacto y el proceso de éxito descelularización por perfusión de detergentes Triton X-100, desoxicolato de sodio y desoxirribonucleasa.
Abstract
Ingeniería de tejidos del páncreas entero puede mejorar los tratamientos actuales para la diabetes mellitus. El objetivo final es páncreas Ingeniero de tejido de un origen alogénico o xenogeneicos con células humanas. Una demostración de los métodos de disección eficiente, descelularización y recelularización de páncreas porcino podría beneficiar el campo. Similar al páncreas humanos, páncreas porcinos tienen un arreglo anatómico especial con tres lóbulos (esplénica, duodenal y conexión) rodeada por el duodeno y el intestino. El lóbulo duodenal del páncreas se conecta con el duodeno por varios vasos sanguíneos. Ingeniería de tejidos del páncreas es complicada debido a su naturaleza exocrina y endocrina. En este documento, se muestra un protocolo detallado para disecar el páncreas entero porcino y decellularize con detergentes ahorrando en su estructura y algunos componentes de la matriz extracelular. Para lograr el total de la perfusión, la aorta es elegida como entrada y la salida de la vena porta. Se unen los otros vasos sanguíneos (arteria hepática, vena esplénica, arteria esplénica, árbol de la arteria y vena mesentérico) y conducto biliar. Para evitar la formación de trombo, el cerdo es heparinizado y, inmediatamente después de la disección, se lava el órgano con heparina frío. Para inhibir la acción de enzimas exocrinas, la descelularización de páncreas se encuentra a 4 º C. La descelularización se realiza por perfusión de Tritón X-100, desoxicolato de sodio y desoxirribonucleasa, con un intermitente y final lavado extenso. Con un éxito descelularización, páncreas aparece blanco, y una evaluación histológica con hematoxilina y eosina muestra una ausencia de núcleos con una estructura de matriz extracelular conservado. Así, el método propuesto puede utilizarse con éxito diseccionar y decellularize Páncreas porcino todo.
Introduction
Diabetes mellitus se caracteriza por la presencia de niveles elevados de glucosa en sangre. Es reconocido como un reto de salud pública importante en la mayoría de países1. Altos niveles de glucosa en la sangre afectan los vasos sanguíneos y sistema nervioso, causando daño a los ojos, el corazón y los riñones y la isquemia de la extremidad. Los métodos tradicionales de tratamiento son las inyecciones de insulina exógena, fármacos y cambios de estilo de vida. Dejando a un lado una cura para la enfermedad, en algunos casos, los tratamientos disponibles no mantener la insulina a niveles terapéuticos, dando por resultado hiperglucemia. Aunque el trasplante de islotes o páncreas entero elimina la enfermedad, no está comúnmente hecho debido a la escasez de órganos de donante conveniente y debido a los riesgos y dificultades de la immunosupresión y encapsulación2.
Mejoras actuales en el campo de la medicina regenerativa e Ingeniería del tejido poseen la capacidad para proporcionar una solución para estos problemas. Con la técnica de descelularización, el material celular de un donante humano o animal puede ser retirado mientras las proteínas importante matriz extracelular (MEC), factores de crecimiento, y moléculas de señalización se conservan en el andamio. Estos andamios potencialmente pueden ser transplantados sin necesidad de inmunosupresión, a restaurar la función del órgano después de recelularización con el no inmunogénica células3,4 del destinatario. Los órganos tejido-dirigida fuentes alogénico o xenogeneicos pueden utilizarse en el trasplante de la clínico, como las proteínas de matriz extracelular importante se conservan entre especies y no pueden ser rechazadas después de trasplante5.
Descelularización es un método bien explorado que implica el uso óptimo de las fuerzas físicas, detergentes químicos y enzimas en un ambiente fisiológico para eliminar material nuclear y las células de un tejido u órgano. Recelularización es un procedimiento de siembra de células en el órgano acelular. Es un procedimiento intelectualmente difícil, que requieren un gran número de células, una estrategia óptima de siembra de células y un sistema de biorreactor para el cultivo de órganos en condiciones fisiológicamente aceptables como temperatura, presión y gases6.
El páncreas puede considerarse un tejido un reto para la ingeniería de tejidos debido a su capacidad exocrina y endocrina. El tejido exocrino segrega varias enzimas digestivas, mientras que la parte endocrina secreta hormonas, incluyendo insulina. La descelularización de páncreas intactos de ratón7,8, humana9y cerdo10 ya ha sido reportado con enzimas (tripsina, desoxirribonucleasa recombinante [ADNasa]) y no iónicos (Triton X-100) y detergentes iónicos () El desoxicolato del sodio [SDC] y dodecil sulfato de sodio [SDS]). Sin embargo, siguiendo los protocolos publicados, luchábamos con disección exitosa y completa perfusión descelularización manteniendo una estructura de la ECM. Especulamos que los detergentes aplicados durante la descelularización causan lisis de las células, de tal modo liberando enzimas digestivas en el órgano. Las enzimas liberadas causará un daño irreversible al andamio de ECM y hacer ineficiente de descelularización y recelularización. Un diseño del método que efectivamente decellularizes páncreas mientras que inhibe la acción de las enzimas digestivas puede solucionar el problema. Elegimos la estrategia de Peloso et al., de la descelularización de páncreas a temperaturas frías, aunque no informó sobre por qué frío es usado9. Al mismo tiempo, hemos diseñado una estrategia de disección con modificaciones de Taylor et al. eligiendo la aorta como una entrada de la perfusión por la Arteria celíaca (CT) y la arteria mesentérica superior (SMA)11.
En un artículo recientemente publicado12, nos muestran un método para el aislamiento eficaz y la descelularización de páncreas porcino conservando algunos componentes de la ECM. En este trabajo, mostrar una descripción detallada de cómo diseccionar un páncreas todo porcino que contiene esplénico, duodenal y lóbulos de conexión y presentar un protocolo progresivo de descelularización exitosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo propuesto, mediante perfusión de COSUDE y Triton X-100 a 4 ° C, decellularize todo porcino páncreas con éxito. El desafío en esta técnica es la disección del páncreas intacta que contiene los tres lóbulos sin dañar el parénquima y sus buques suministros, así como la ligadura de las otras ramas vasculares del espécimen para la perfusión del órgano sin salida. El páncreas porcino tiene una anatomía diferente en comparación con el páncreas humano. Consta de tres lóbulos y permanece en estrecho contacto con el intestino delgado por la parte que lo rodea. Diseccionamos el duodeno junto con el páncreas, como varios vasos sanguíneos de páncreas conectar el intestino. Durante los estudios de optimización, corte embotado de estos vasos sanguíneos ha demostrado la salida y una incompleta perfusión de soluciones.
Ya que la aorta se conecta con el páncreas a través de las arterias mesentéricas superiores y celíacos, elegimos la aorta como una entrada para la perfusión sencilla solo utilizando una cánula y, por tanto, una entrada. En nuestra experiencia, la ligadura de la aorta por encima del CT y por debajo de la SMA reducirá el tiempo de la disección y reduce el riesgo de dañar alguno de los dos vasos. Además de un cerdo heparinizado, también notamos que una perfusión de heparina frío a través de la aorta inmediatamente después de la disección ayuda en la realización de la perfusión de soluciones en todo el órgano. Especulamos que si esto se produce al evitar la formación de coágulos de sangre en los vasos sanguíneos. La perfusión inicial de un páncreas con agua ultrapura después de la disección se Lisan glóbulos rojos y eliminar los restos de sangre en el órgano, impidiendo la formación de coágulos de sangre. Este período también puede utilizarse para encontrar cualquier unligated pequeñas ramas de venas y arterias, como flujo de sangre se puede notar fácilmente sobre el fondo.
Optamos por mantener el procedimiento de descelularización todo en frío (4 ° C), como esto obstaculizará la acción de enzimas exocrinas que liberan de las células exocrinas del páncreas. Las enzimas exocrinas, cuando no se inhibe, pueden causar un efecto deletéreo sobre las células y la MEC, como que pueden digerir las membranas celulares y proteínas12. Como la congelación y descongelación pueden explotar eficazmente las células y se incluyeron un paso de congelación/descongelación, inicialmente incluso antes de la perfusión de detergentes4,13. El lavado inicial después de descongelar elimina los restos de la célula estalla. El tratamiento detergente que utilizamos es una mezcla de COSUDE y Triton X-100 en concentraciones inusualmente altas y a una velocidad de perfusión alta. Elegimos este enfoque para lograr más rápido descelularización mediante la eliminación de las células exocrinas que dañar el ECM. Especulamos que un protocolo rápido y duro es beneficioso de descelularización de páncreas, como menos tiempo estará disponible para las enzimas pancreáticas interactuar con el ECM, preservando así buenos componentes de ECM. Para preservar los componentes de la ECM, también hemos añadido inhibidor de la proteasa de serina (PMSF) a las soluciones de detergente, ya inhiben la activación de enzimas liberadas desde las células exocrinas14. Azida de sodio se agrega a todas las soluciones de descelularización, ya que actúa como un agente bacteriostático, inhibiendo la posibilidad de contaminación bacteriana15.
El páncreas decellularized siguiendo este protocolo demostrada una preservación de las estructuras de la ECM y el ECM proteínas colágeno y elastina. Sin embargo, una pérdida significativa de glicosaminoglicanos fue notada en el páncreas decellularized. El páncreas decellularized de esta manera también demostrada la promesa para el accesorio de células madre de páncreas fetales humanos y la expresión de marcadores exocrinas y endocrinas en piezas recellularized para 14 días12. Sin embargo, para generar un páncreas intacto y funcional, se requiere investigación adicional en la evaluación de celular correcto fuentes, tipos de la célula, célula siembra estrategias y cultura biorreactor.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por una subvención del gobierno LUA ALF sueco a la S.S.H.
Materials
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
References
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