والعزلة وديسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير كله
Summary
هندسة الأنسجة في البنكرياس كله يشكل تحديا بسبب وظائفها إفرازات والغدد الصماء. نعرض طريقة للتشريح بنكرياس الخنزير سليمة وعملية ناجحة ديسيلولاريزيشن من نضح المنظفات X-100 تريتون، ديوكسيتشولاتي الصوديوم، وديوكسيريبونوكليسي.
Abstract
هندسة الأنسجة في البنكرياس كله يمكن تحسين العلاجات الحالية لمرض البول السكري. والهدف النهائي مهندس أنسجة البنكرياس من مصدر متمكنة أو إكسينوجينيك مع الخلايا البشرية. وقد يستفيد مظاهرة أساليب للتشريح تتسم بالكفاءة، وديسيلولاريزيشن، وريسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير الحقل. أقرب إلى البنكرياس البشرية، يكون البنكرياس الخنزير ترتيب تشريحي خاص مع الفصوص الثلاثة (الطحال، الإثناعشرية، واتصال) مقربا من الإثني عشر والأمعاء الدقيقة. الفص الإثناعشرية البنكرياس يتصل العفج بالعديد من الأوعية الدموية الصغيرة. هندسة الأنسجة البنكرياس معقدة بسبب طابعها إفرازات الغدد الصماء. في هذه الورقة، ونظهر بروتوكول مفصل لتشريح البنكرياس كله الخنزير وديسيلولاريزي مع المنظفات أثناء حفظ هيكلها وبعض عناصر المصفوفة خارج الخلية. ولتحقيق التروية الكاملة، يتم اختيار الشريان الاورطي كمدخل والوريد البابي كمخرج. هي متصلة الأوعية الدموية (الشريان الكبدي، المنوال الطحال، شريان الطحال، شجرة الشريان والوريد المساريقي العلوي) وأخرى من القناة الصفراوية. هو هيبارينيزيد لمنع تكوين خثرة، الخنزير، ومباشرة بعد التشريح، يتم مسح الجهاز مع الهيبارين الباردة. أن يعوق عمل إفرازات الإنزيمات، يتم تعيين ديسيلولاريزيشن البنكرياس عند 4 درجة مئوية. ديسيلولاريزيشن يقوم نضح X-100 تريتون، ديوكسيتشولاتي الصوديوم، وديوكسيريبونوكليسي، مع غسيل واسعة النطاق المتقطع والنهائي. مع ديسيلولاريزيشن نجاح، البنكرياس تظهر بيضاء، وإجراء تقييم نسيجية ذات الهيماتوكسيلين ويوزين يبين وجود نويات ذات هيكل مصفوفة خارج الخلية يتم الحفاظ عليها. وهكذا، يمكن استخدام الطريقة المقترحة لتشريح وديسيلولاريزي بنكرياس الخنزير كله بنجاح.
Introduction
مرض البول السكري يتميز بوجود مستويات متزايدة من الجلوكوز في الدم. فإنه يعتبر تحديا رئيسيا لصحة العامة في معظم البلدان1. مستويات عالية من الجلوكوز في الدم تؤثر على الأوعية الدموية والجهاز العصبي، مما تسبب في أضرار للعيون والقلب، والكلى وأقصى الاسكيمية. وتشمل الطرق التقليدية للعلاج حقن الأنسولين الخارجية، والمخدرات، والتغييرات في أسلوب الحياة. وضع جانبا علاج لهذا المرض، وفي بعض الحالات، تفشل العلاجات المتاحة للحفاظ على الأنسولين على المستويات العلاجية، أسفر عن ارتفاع السكر في الدم. وبالرغم من أن زرع الجزيرات أو البنكرياس كله يزيل المرض، لم يتم عادة ذلك بسبب نقص في الهيئات المانحة مناسبة والمخاطر والصعوبات التي ينطوي عليها من الكبت المناعي وتغليف2.
التحسن الحالي في الميدان الطب الهندسة والتجدد الأنسجة تمتلك القدرة على تقديم حل لهذه المسائل. مع تقنية ديسيلولاريزيشن، يمكن إزالة المواد الخلوية من مانح الإنسان أو الحيوان بينما البروتينات الهامة المصفوفة خارج الخلية (ECM)، عوامل النمو، ويتم الحفاظ على جزيئات الإشارات في السقالة. يمكن يحتمل أن يكون زرع هذه السقالات دون الحاجة للكبت المناعي، لاستعادة وظيفة الجهاز بعد ريسيلولاريزيشن مع3،الخلايا الجذعية غير مكسبه للمستلم4. يمكن استخدام أجهزة هندسة الأنسجة من مصادر متمكنة أو إكسينوجينيك في زرع السريرية، البروتينات المصفوفة خارج الخلية الرئيسية هي المحافظة فيما بين الأنواع، وقد لا يرفض بعد زرع5.
ديسيلولاريزيشن أسلوب جيد استكشاف التي تنطوي على الاستخدام الأمثل للقوى المادية والمنظفات الكيماوية والأنزيمات في إعداد فسيولوجية إزالة المواد النووية والخلايا من الأنسجة أو الجهاز. ريسيلولاريزيشن إجراء لبذر خلايا مرة أخرى إلى الجهاز اللاخلوي. إجراء فكريا صعبة، تتطلب عدد كبير من الخلايا، واستراتيجية البذر خلية أمثل، ونظام مفاعل حيوي لثقافة الجهاز في ظروف مقبولة من الناحية الفسيولوجية مثل درجة الحرارة والضغط والغازات6.
ويمكن اعتبار البنكرياس نسيج تحديا لهندسة الأنسجة بسبب قدراته إفرازات الغدد الصماء. الأنسجة إفرازات تفرز عدة إنزيمات الجهاز الهضمي، في حين أن الجزء الغدد الصماء تفرز الهرمونات، بما في ذلك الأنسولين. ديسيلولاريزيشن البنكرياس سليمة من الماوس7،8و البشرية9خنزير10 سبق ذكر استخدام الإنزيمات (التربسين، ديوكسيريبونوكليسي [الدناز]) ومن (المنظفات الأيونية وغير الأيونية (Triton X-100) ديوكسيتشولاتي الصوديوم [المركز] ودوديسيل كبريتات الصوديوم [الحزب الديمقراطي الصربي]). ومع ذلك، عقب البروتوكولات المنشورة، نحن نناضل مع تشريح الناجحة، ونضح كاملة وديسيلولاريزيشن مع الحفاظ على بنية إدارة المحتوى في المؤسسة. نحن تكهنت أن المنظفات التطبيقية أثناء ديسيلولاريزيشن يسبب تحلل للخلايا، ثم الإفراج عن الإنزيمات الهضمية في الجهاز. سوف يتسبب ضرر لا يمكن إصلاحه سقالة ECM الإنزيمات المفرج عنهم وجعلها غير فعالة ديسيلولاريزيشن وريسيلولاريزيشن. تصميم الأسلوب الذي ديسيلولاريزيس فعالية البنكرياس بينما يعوق عمل إنزيمات الجهاز الهضمي قد يحل المشكلة. لقد اخترنا استراتيجية بيلوسو et al.، من ديسيلولاريزيشن في البنكرياس عند درجة حرارة باردة، على الرغم من أنها لم تبلغ عن السبب تستخدم9درجات الحرارة الباردة. في الوقت نفسه، قمنا بتصميم استراتيجية تشريح مع تعديلات من تايلور et al. باختيار الشريان الاورطي كمدخل التروية جذع الهضمية (CT) و الشريان المساريقي العلوي (SMA)11.
في مقال نشر مؤخرا12، نبدي أسلوب العزل الفعال وديسيلولاريزيشن من بنكرياس الخنزير مع الحفاظ على بعض مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة. في هذه الورقة، وإظهار وصف مفصل لكيفية تشريح بنكرياس الخنزير كله تتضمن الطحال، الإثناعشرية، واتصال الفصوص، ويقدم بروتوكول التدرجي لنجاح ديسيلولاريزيشن.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المقترح، استخدام التروية السويسرية و X-100 تريتون في 4 درجات مئوية، وسوف ديسيلولاريزي بنكرياس الخنزير كله بنجاح. ويتمثل التحدي في هذا الأسلوب تشريح البنكرياس سليمة تتضمن جميع الفصوص الثلاثة دون الأضرار لحمه وسفن الإمداد لها، فضلا عن ربط الأوعية الدموية الفروع الأخرى للعينة من أجل نتخلل الجهاز دون تسرب. وقد البنكرياس النقانق تشريح مختلفة مقارنة بالبنكرياس البشرية. ويتكون من ثلاثة فصوص، ويبقى على اتصال وثيق مع الأمعاء الدقيقة عن طريق جزئيا المحيطة به. نحن تشريح العفج جنبا إلى جنب مع البنكرياس، كما العديد من الأوعية الدموية الصغيرة من البنكرياس توصيل الأمعاء. خلال الدراسات الأمثل، قد أظهرت قطع حادة لهذه الأوعية الدموية التسرب ونضح ناقصة الحلول.
حيث يربط الشريان الاورطي إلى البنكرياس عن طريق الشرايين المساريقي العلوي الهضمية ومتفوقة، اخترنا الشريان الاورطي كمداخل للحفاظ التروية بسيطة باستخدام قنية واحد، ومن ثم مدخل واحد فقط. في تجربتنا، ربط الشريان الاورطي أعلاه الأشعة المقطعية وأدناه SMA سينخفض وقت تشريح ويقلل من خطر إلحاق الضرر بأي من السفينتين. وبالإضافة إلى خنزير هيبارينيزيد، ولاحظنا أيضا أن نضح من الهيبارين الباردة عبر الشريان الاورطي مباشرة بعد التشريح يساعد في تحقيق نضح حلول في جميع أنحاء الجهاز. يمكننا التكهن إذا كان هذا يحدث عن طريق منع تكوين جلطات الدم في الأوعية الدموية. سوف نضح الأولية البنكرياس مع الماء عالي النقاوة بعد تشريح خلايا الدم الحمراء وإزالة بقايا الدم في الجهاز، مما يحول دون تشكيل الجلطات الدموية. يمكن أيضا استخدام هذه الفترة للبحث عن أي فروع صغيرة أونليجاتيد الأوردة والشرايين، كما يمكن بسهولة ملاحظة تدفق الدم فوق الخلفية.
اخترنا أن يبقى الإجراء ديسيلولاريزيشن كله في درجات حرارة باردة (4 درجة مئوية)، كهذا سوف يعوق عمل إفرازات الإنزيمات التي تطلق من إفرازات خلايا البنكرياس. يمكن أن يسبب إفرازات الإنزيمات، عندما لا يعوق، تأثير ضار على الخلايا وإدارة المحتوى في المؤسسة، كما أنها يمكن هضم أغشية الخلية والبروتينات12. كما يمكن أن انفجر تجميد والغاء فعالية الخلايا، قمنا بتضمين خطوة تجميد/ذوبان الجليد، في البداية حتى قبل التروية من المنظفات4،13. الغسيل الأولى بعد ذوبان الجليد سيؤدي إلى إزالة بقايا رشقات نارية باتجاه الخلية. معاملة المنظفات استخدمنا عبارة عن مزيج من المركز و X-100 تريتون في تركيزات مرتفعة على نحو غير عادي، وفي سرعة عالية التروية. لقد اخترنا هذا النهج لتحقيق ديسيلولاريزيشن أسرع عن طريق إزالة إفرازات الخلايا التي تلحق الضرر إدارة المحتوى في المؤسسة. يمكننا التكهن بأن بروتوكول الجاد والسريع مفيد للبنكرياس ديسيلولاريزيشن، كما ستكون متاحة لإنزيمات البنكرياس للتفاعل مع المحتوى، ومن ثم الحفاظ على حسن إدارة المحتوى في المؤسسة مكونات وقت أقل. للحفاظ على مكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، أضفنا أيضا سيرين مثبط البروتياز (بمسف) للحلول المنظفات، كما أنه سوف تمنع تنشيط الإنزيمات أطلق سراحهم من الخلايا إفرازات14. أزيد الصوديوم يضاف إلى جميع ديسيلولاريزيشن الحلول، كما أنها بمثابة عامل والاريثروسين، مما يحول دون فرصة للتلوث البكتيري15.
ديسيلولاريزيد البنكرياس بعد هذا البروتوكول الحفاظ على هياكل إدارة المحتوى في المؤسسة وإدارة المحتوى في المؤسسة بروتينات الكولاجين والايلاستين وأظهرت. ومع ذلك، لوحظ في البنكرياس ديسيلولاريزيد خسارة كبيرة من الجليكوزامينوجليكان. ديسيلولاريزيد البنكرياس في هذا الشكل كما أظهرت الوعد لمرفق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في البنكرياس والتعبير عن علامات إفرازات الغدد الصماء، وفي ريسيلولاريزيد لمدة 14 يوما12قطعة. ومع ذلك، لتوليد بنكرياس سليمة والوظيفية، مطلوب إجراء مزيد من البحوث في تقييم مصادر الخلية الصحيحة وأنواع الخلايا، خلية استراتيجيات البذر والثقافة مفاعل حيوي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومولت هذه الدراسة بمنحه من “ألف لوا الحكومة السويدية” إلى S.S.H.
Materials
| 4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
| 2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
| Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
| DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
| Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
| Heparin | Leo | 387107 | |
| Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
| Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
| PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
| SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
| Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
| Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
| Suture | Vömel | 14817 | |
| Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
| Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |
References
- Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
- Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43 (2015).
- Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
- Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645 (2015).
- Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
- Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
- Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
- Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145 (2017).
- Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534 (2017).
- James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
- Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).
