Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

La caja de herramientas genética para genes específicos se ha desarrollado bien en Drosophila, convirtiéndolo en uno de los mejores sistemas de modelo para investigar la función de genes implicados en una amplia variedad de procesos celulares. Sistemas de expresión binaria, como levadura Gal4/UAS (secuencia de activación upstream), primero fue adoptada para regiones reventado y gen potenciador de tejidos específicos en el modelo genético de Drosophila ¹ (figura 1). Este sistema facilita el desarrollo de un gran número de técnicas tales como la regulación espacio-temporal de sobreexpresión de genes, regiones, golpe de gracia en determinados grupos de células, así como en la ablación de la célula, marca de celular, en rastreo de celulares y moleculares procesos en el embrión y los tejidos, rastreo de linaje y mosaico análisis durante el desarrollo. Un número del sistema binario de la transcripción, como la bacteriana LexALexA_op (figura 1) y Q-sistema de Neurospora , son poderosas herramientas genéticas que son ampliamente utilizados en Drosophila, además el original sistema de Gal4/UAS dirigida gene expresión^1,2,3.

Aquí, presentamos un método para generar sistema fiable expresión binaria de tejidos específicos mediante el empleo de una técnica de edición del genoma. Los recientes avances en la tecnología de edición CRISPR/Cas9 genoma han permitido oportunidades sin precedentes hacer cambios de genoma dirigido en una amplia gama de organismos. En comparación con las otras técnicas de edición de genoma disponible, el sistema CRISPR/Cas9 es barato, eficiente y confiable. Esta tecnología utiliza componentes del sistema inmune adaptativo bacteriano: una endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes que crea una rotura de doble cadena (DSB) y un ARN quimérico guía (gRNA), que guía la Cas9 a un sitio particular del genoma para específicas OSD⁴. Las células contienen la maquinaria para reparar el OSD mediante diferentes vías. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) lleva a pequeñas inserciones o eliminaciones interrumpir funciones de los genes, mientras que la reparación dirigida de homología (HDR) presenta un definida dirigida/deseable genómico knock-en/knock-out mediante un donador exógeno de HDR como una plantilla. La estrategia de reemplazo basada en HDR puede utilizarse eficientemente para generar un sistema altamente confiable expresión binaria de tejidos específicos, que puede superar todas las limitaciones de los métodos de trampa tradicional potenciador. Describimos un procedimiento paso a paso para la utilización de reparación HDR CRISPR/Cas9-basado en la generación de una línea de controlador binario de transcripción que se expresa bajo el control de la regulación transcripcional y postranscripcional endógena de un Drosophila gen. En este protocolo, se demuestra la generación de una línea de controlador específica para servicios (bnl) gen codificando una proteína familia FGF que regula la morfogénesis ramificación de la vía aérea traqueal epitelio⁵. En este ejemplo, el primer exón de la codificación del gene del bnl fue substituido por la secuencia de una secuencia de transactivator bacteriana LexA sin alterar cualquier endógeno cis-secuencias reguladoras del gene del bnl . Nos muestran que la estrategia genera una línea de conductor de bnl-LexA que spatiotemporally controla la expresión de un gen reportero colocado aguas abajo de LexAoperator (LexAop o LexO) exclusivamente en bnl- expresando las células epiteliales/mesenquimales/neuronal.