Эффективная стратегия для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы путем изменения генома
Summary
Здесь мы представляем метод для генерации двоичного транскрипции ткани конкретных систем у дрозофилы , заменив первый кодирования экзона генов с драйверами транскрипции. Метод на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 места transactivator последовательность под эндогенного регулирования сменил гена и следовательно облегчает transctivator выражение исключительно в пространственно-временных структур ген специфического.
Abstract
Системы Бинарные транскрипции являются мощные генетических инструменты широко используются для визуализации и обработки клеток судьба и ген выражение в конкретных группах клеток или тканей в модельных организмов. Эти системы содержат два компонента как отдельный трансгенных линий. Линии драйвер выражает transcriptional активатор под контролем ткани конкретных промоутеров/усилители и гаваней линии репортер/эффектор, целевого гена размещены ниже по течению на сайт связывания активатор транскрипции. Животные, укрывательство обоих компонентов побудить transactivation ткани конкретного целевого выражения гена. Точное пространственно-временных выражение гена в целевых тканях имеет решающее значение для объективное освещение деятельности клеток/ген. Таким образом разработка метода для создания эксклюзивных клеток/тканей конкретных драйверов линии имеет важное значение. Здесь мы представляем метод для создания системы весьма ткани конкретных целевых выражение, используя «кластерный регулярно Interspaced короткие палиндром Repeat/ТРИФОСФАТЫ связанные» (ТРИФОСФАТЫ/Cas)-основанные геном редактирования технику. В этом методе эндонуклеазы, которую Cas9 является объектом двух химерных руководство РНК (gRNA) на определенных сайтах в первом кодирования экзона гена в геном дрозофилы для создания двухнитевые разрывы (DSB). Впоследствии с помощью внешних доноров плазмида, содержащий последовательность transactivator, клетки автономного ремонт техники позволяет гомологии направленных ремонт (HDR) ОРС, в результате точного удаления и замены экзона с transactivator последовательности. Постучал в transactivator выражается исключительно в клетках где СНГ-регулирующие элементы заменены гена являются функциональными. Подробные пошаговые протокола, представленные здесь для генерации двоичного транскрипционный анализ драйверов, выраженные в ФБП дрозофилы/внеофисного-производящ клетки эпителия/нейронов может быть принят для любого выражения конкретных генов или ткани.
Introduction
Генетических элементов для экспрессии целевых генов был хорошо развита у дрозофилы, что делает его одним из лучших систем модель для изучения функции генов, вовлеченных в самых разнообразных клеточных процессов. Двоичные выражения систем, таких как дрожжи Gal4/Уан (вверх по течению активации последовательности), впервые был принят для ткани конкретных усилитель треппинга и Джин которое в дрозофилы генетических модель1 (рис. 1). Эта система способствовала развитию большое количество методов, таких как пространственно-временных правил гиперэкспрессия генов, которое, нокаут в отдельных групп клеток, также как и абляции клеток, клеток маркировки, Живая трассировка клеточной и молекулярной процессы в эмбриона и тканей, линии трассировки и мозаика анализов во время разработки. Количество двоичных транскрипции системы, такие как бактериальный LexA/LexAОП системы (рис. 1) и Нейроспора Q-системы, являются мощными инструментами генетических, которые сейчас широко используются в дрозофилы, в дополнение к Оригинальный Gal4/Уан система для целевых генов выражение1,2,3.
Здесь мы представляем метод для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, используя метод изменения генома. Последние достижения в технологии редактирования генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9 позволили беспрецедентные возможности для изменения направлены генома в широком диапазоне организмов. По сравнению с других методов редактирования доступны генома, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система является эффективной, недорогой и надежный. Эта технология использует компоненты бактериальных адаптивной иммунной системы: Cas9 эндонуклеазы Streptococcus pyogenes , который создает двухручьевой перерыв (DSB) и химерных руководство РНК (gRNA), которая направляет на конкретной генома сайт для Cas9 целевые DSB4. Ячейки содержат машины для ремонта DSB, используя различные пути. Non гомологичных конец присоединения (NHEJ) приводит к небольшой вставки или удаления нарушить функции гена, в то время как ориентированные на гомологии ремонт (HDR) вводит определенные направлены/желательно геномной в/стучите нокаут с помощью внешних доноров HDR как шаблон. Стратегии на основе HDR замена эффективно могут быть использованы для создания высоконадежных ткани конкретных двоичные выражения системы, которая может преодолеть все ограничения методов ловушку традиционной усилитель. Мы описываем пошаговые процедуры для использования на основе ТРИФОСФАТЫ/Cas9 HDR ремонта в генерации двоичного транскрипции драйвер линии, которая выражается под контролем эндогенного транскрипционный анализ и post-transcriptional регулирования дрозофила гена. В этом протоколе, мы демонстрируем поколения специфических для драйвера линии внеофисного гена (bnl) кодирования ФБП семьи протеина, который регулирует ветвления морфогенез эпителия трахеи сократимость5. В этом примере первый кодирования экзона гена bnl был заменен последовательность бактериальной Лекса transactivator последовательность без изменения любых эндогенных СНГ-регулирования последовательностей гена bnl . Мы покажем, что стратегия создается линия драйвер Bnl Лекса , spatiotemporally управляет экспрессии гена репортера, размещенных ниже по течению от LexAoperator (LexAop или LexO) исключительно в bnl- выражая эпителиальных/мезенхимальных/нейрональных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционно Drosophila enhancer ловушки были получены двумя различными способами. Один из способов включает случайные вставки водителя (например., Gal4) последовательность в геноме, транспонирования (например., P-элемент транспонирования)1 . Кроме того водитель последов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р F. порт, доктор K. о ‘ Коннор-Джайлс и д-р S. Фэн для обсуждения стратегии ТРИФОСФАТЫ; Д-р т.б. Корнберг и центр фондовой Блумингтон реагентов; UMD изображений основного фонда; и финансирование из низ: R00HL114867 и R35GM124878 в СР.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
