Uma estratégia eficiente para gerar sistemas de transcrição binário de tecido-específica em Drosophila editando genoma

A caixa de ferramentas genética para a expressão do gene alvo bem desenvolveu-se em Drosophila, tornando-o um dos melhores sistemas de modelo para investigar a função de genes envolvidos em uma ampla variedade de processos celulares. Sistemas de expressão binário, como fermento Gal4/UAS (sequência de ativação upstream), foi adotado inicialmente por misexpression de trapping e gene potenciador de tecido-específica na drosófila genética modelo¹ (Figura 1). Este sistema facilitou o desenvolvimento de um grande número de técnicas como spatiotemporal regulamento da superexpressão do gene, misexpression, nocaute em grupos selecionados de células, bem como em ablação de célula, marcação de célula, ao rastreamento de celular e molecular processos em embriões e tecidos, rastreamento de linhagem e análises de mosaico durante o desenvolvimento. Um número do sistema binário de transcrição, tais como o bacteriana LexA/ sistemaLexA_op (Figura 1) e Q-sistema de Neurospora , são poderosas ferramentas genéticas que são amplamente utilizadas em Drosophila, além de o sistema original de Gal4/UAS para expressão de gene alvo a^1,2,3.

Aqui, apresentamos um método para gerar o sistema altamente confiável tecido-específica de expressão binário empregando uma técnica de edição de genoma. Aos recentes avanços na tecnologia de edição CRISPR/Cas9 genoma permitiu oportunidades sem precedentes para fazer mudanças de direção do genoma em uma ampla gama de organismos. Em comparação com outras técnicas de edição disponíveis do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 é barato, eficiente e confiável. Esta tecnologia utiliza componentes do sistema imune adaptativo bacteriano: uma endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes que cria uma ruptura da dobro-Costa (DSB) e um RNA guia Quimérico (gRNA), que orienta a Cas9 para um site específico do genoma para alvo de ORL⁴. As células contêm a maquinaria para reparar o ORL usando diferentes caminhos. Não-homóloga final juntando (NHEJ) leva a pequenas inserções ou exclusões para perturbar a função dos genes, enquanto reparo homologia-dirigido (HDR) introduz um definido dirigido/desejável genômica em/TOC-nocaute usando um doador HDR exógeno como um modelo. A estratégia de substituição baseada em HDR com eficiência pode ser utilizada para gerar um sistema altamente confiável expressão binário de tecido-específica, que pode superar todas as limitações dos métodos tradicionais potenciador armadilha. Descrevemos um procedimento passo a passo para a utilização do reparo HDR CRISPR/Cas9-baseado na geração de uma linha de driver binário da transcrição que se expressa sob o controle de endógena regulação transcricional e pós-transcricional de um da drosófila gene. Neste protocolo, demonstramos a geração de uma linha de motorista específica para branchless (bnl) gene que codifica uma proteína de família FGF que regula a morfogênese de ramificação da via aérea traqueal epitélio⁵. Neste exemplo, o primeiro exon codificação do gene da bnl foi substituído pela sequência de uma sequência de liberada bacteriana LexA sem alterar qualquer endógena cis-sequências reguladoras do gene do bnl . Mostramos que a estratégia gerou uma linha de motorista bnl-LexA que spatiotemporally controla a expressão de um gene repórter, colocado a jusante do LexAoperator (LexAop ou seguir) exclusivamente na bnl- expressando as células epiteliais/mesenquimais/neuronal.