ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略
Summary
ショウジョウバエの遺伝子の最初のコーディングのエクソンを転写ドライバーと置き換えることにより組織特異的転写、バイナリ システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ベースのメソッド交換遺伝子の内因性の規制の下での転写活性化シーケンスを配置、その結果遺伝子特定の時空間パターンを排他的に transctivator 式が容易になります。
Abstract
バイナリ転写システムは、広く可視化して細胞の特定のグループの細胞運命と遺伝子発現やモデル生物の組織を操作するための強力な遺伝的ツールです。これらのシステムは、個別の遺伝子組換え行に 2 つのコンポーネントを含まれています。ドライバーのラインはターゲット遺伝子は転写活性化因子の結合部位に下流に置かれたレポーター/エフェクター ライン港湾組織固有のプロモーター/エンハンサーは、の管理下の転写活性化因子を表しています。両方のコンポーネントをかくまっている動物は、ターゲット遺伝子発現の組織特異を転写活性化を誘導します。対象となる組織の遺伝子発現の正確な時空間は、細胞・遺伝子活動の公平な解釈にとって重要です。したがって、排他的な細胞/組織固有のドライバーの行を生成するための手法の開発が不可欠です。ここで採用することにより高い組織特異的標的発現システムを生成する手法を提案、「定期的にクラスター化 Interspaced 短い回文繰り返し/CRISPR 関連」(CRISPR/Cas)-ゲノム編集技術をベース。このメソッドでは、Cas9 は、2 つのキメラを狙われてエンドヌクレアーゼ (DSB) の二重鎖切断を作成するショウジョウバエのゲノムの遺伝子の最初のコーディングのエクソンの特定のサイトに Rna (gRNA) をガイドします。転写活性化シーケンスを含む外因性ドナー プラスミドを使用すると、その後、セル自律修復機械正確な削除と、トランスと、エクソンの交換の結果、DSB のホモロジー監督修復 (HDR) が可能にします。シーケンス。ノックでトランスは細胞でのみ発現するcis-置き換えられた遺伝子の調節配列が機能。ショウジョウバエ fgfで表されるバイナリ転写ドライバーを生成するここで説明した詳細なステップバイ ステップ プロトコル/無店舗-任意遺伝子の組織特異的発現に採用されることができます/神経上皮細胞を作り出します。
Introduction
ターゲット遺伝子発現の遺伝のツールボックスをショウジョウバエ、それにさまざまな細胞プロセスにかかわる遺伝子の機能を調べるための最高のモデル システムの 1 つでも開発しました。ショウジョウバエの遺伝学的モデル1 (図 1) で組織固有のエンハンサー トラップと遺伝子ヒトのGal4/UA (上流活性化配列)、酵母などのバイナリ表現システム初採用。このシステムは、多数の遺伝子の過剰発現、ヒト、セルもセル アブレーション、セル マーキング、細胞と分子のライブ トレースの選択されたグループでノックアウトの時空間的制御などの技術の開発を促進開発中にモザイク解析トレースする血統と組織胚プロセス。LexA細菌のようなバイナリの転写システムの数/LexAopシステム (図 1) およびアカパンカビQ システム、強力な遺伝学的ツールに加えて、ショウジョウバエ、広く使われるようになりました目標とされた遺伝子発現1,2,3元の Gal4/UAS システム。
ゲノム編集技術を採用することにより信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する方法を紹介します。CRISPR/Cas9 ゲノム編集技術の最近の進歩は、有機体の広い範囲で指示されたゲノムを変更する前例のない機会を許可しています。その他の利用可能なゲノム編集技術と比較して、CRISPR/Cas9 システムは安価で効率的、かつ信頼性の高いです。この技術は細菌の適応免疫系の構成要素を利用:化膿連鎖球菌二重鎖切断 (DSB) を作成して特定のゲノムのサイト、Cas9 をガイドするキメラ ガイド RNA (gRNA) の Cas9 エンドヌクレアーゼターゲットを絞った DSB4。セルには、異なる経路を用いて DSB の修復する機械が含まれて。非相同末端結合 (NHEJ) は、ホモロジー監督修理 (HDR) がテンプレートとして外因性の HDR ドナーを使用して、定義された監督/望ましいゲノム ノック-/ノック アウトを紹介しながら遺伝子機能を混乱させる小さな挿入または削除に します。HDR ベース交換戦略は、伝統的なエンハンサー トラップ法のすべての制限を克服することができます信頼性の高い組織固有のバイナリ表現システムを生成する効率的に利用できます。ショウジョウバエの内因性転写と転写後調節の制御の下で表されるバイナリ転写ドライバー行を生成する HDR の CRISPR/Cas9 ベース修理の利用手順について述べる遺伝子。このプロトコル ドライバーのラインのために特定の世代を示す無店舗気管の気道上皮5の分岐の形態形成を調節する FGF ファミリー蛋白質 (bnl) 遺伝子。この例では、 bnl遺伝子の最初のコーディング エクソンが細菌LexA転写活性化シーケンスのシーケンスによって、内因性のcisを変更することがなく置き換えられました- bnl遺伝子の制御配列。戦略が時空bnl –排他的にLexAoperator (LexAopまたはシャワー) の下流に配置されますレポーター遺伝子の発現を制御するbnl LexAドライバー行を生成することを示す上皮・間葉系/神経細胞を表現します。
Protocol
Representative Results
Discussion
伝統的に、ショウジョウバエエンハンサー トラップは、2 つの異なるメソッドによって生成されました。いずれかのドライバーのランダム挿入が含まれています (例えば。、 Gal4) 転位によってゲノムのシーケンス (e.g。、P 要素の転位)1 。また、ゲノム3,11の異所性サイトに統合される、プラスミドの構成体で推…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRISPR 戦略に関する議論、博士・ f ・ ポート、博士・ k ・ オコナー-ジャイルズと博士 s. 風水に感謝します。博士結核コーンバーグと試薬; ブルーミントン ストック センターUMD イメージングの中核施設。NIH の資金調達: R00HL114867 と R35GM124878 の sr。
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
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