Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Casella degli strumenti genetico per espressione genica mirata è stato ben sviluppato in Drosophila, che lo rende uno dei migliori sistemi di modello per studiare la funzione dei geni coinvolti in un’ampia varietà di processi cellulari. Sistemi di espressione binaria, come il lievito Gal4/UAS (sequenza di attivazione a Monte), fu adottato per risultati di intrappolamento e gene tessuto-specifici enhancer in Drosophila modello genetico¹ (Figura 1). Questo sistema ha facilitato lo sviluppo di un gran numero di tecniche come la regolazione spazio-temporale della sovraespressione genica, risultati, Ko in gruppi selezionati di cellule pure come ablazione delle cellule, cellule marcatura, tracciatura dal vivo di cellulari e molecolari processi in embrione e tessuti, lignaggio traccia e analisi di mosaico durante lo sviluppo. Un numero del sistema binario trascrizione, ad esempio il batterica LexA/LexA_op system (Figura 1) e Neurospora Q-system, sono potenti strumenti genetici che ora sono ampiamente usati in Drosophila, oltre a l’originale sistema Gal4/UAS per gene bersaglio espressione^1,2,3.

Qui, presentiamo un metodo per generare il sistema altamente affidabile tessuto-specifica espressione binaria impiegando una tecnica di modifica del genoma. I recenti progressi nella tecnologia di editing CRISPR/Cas9 genoma hanno permesso opportunità senza precedenti per apportare modifiche di genoma diretto in una vasta gamma di organismi. Rispetto ad altre tecniche di editing disponibili genoma, il sistema CRISPR/Cas9 è economico, efficiente e affidabile. Questa tecnologia utilizza componenti del sistema immunitario adattativo batterico: un’endonucleasi di Cas9 di Streptococcus pyogenes che crea una rotture a doppio filamento (DSB) e un RNA chimerico guida (gRNA), che guida il Cas9 a un sito particolare genoma per mirati DSB⁴. Le cellule contengono i macchinari per riparare il DSB utilizzando percorsi diversi. Non-omologa fine unirsi (NHEJ) conduce a piccoli inserimenti o eliminazioni di perturbare la funzione del gene, mentre riparazione omologia-diretto (HDR) introduce un definito diretto/desiderabile genomico knock-in/knock-out utilizzando un donatore HDR esogeno come modello. La strategia di sostituzione basato su HDR possa essere utilizzata in modo efficiente per generare un sistema altamente affidabile espressione binaria di tessuto-specifici, in grado di superare tutte le limitazioni dei metodi tradizionali enhancer trap. Descriviamo una procedura dettagliata per l’utilizzo di riparazione basato su CRISPR/Cas9 HDR nella generazione di una linea di driver binario trascrizione che si esprime sotto il controllo del regolamento endogeno trascrizionale e di un di Drosophila gene. In questo protocollo, dimostriamo la generazione di una linea di driver specifica per prive (bnl) gene codifica per una proteina di famiglia di FGF che regola la morfogenesi di ramificazione della via aerea tracheale epitelio⁵. In questo esempio, il primo esone codifica del gene di bnl è stato sostituito dalla sequenza di una sequenza di transactivator LexA batterica senza alterare qualsiasi endogeno cis-sequenze regolarici del gene di bnl . Mostriamo che la strategia generato una linea di driver di bnl-LexA che spatiotemporally controlla l’espressione di un gene del reporter posizionato a valle di LexAoperator (LexAop o LexO) esclusivamente in bnl- che esprimono le cellule epiteliali/mesenchymal/neuronali.