Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Die genetische Toolbox für gezielte Genexpression wurde gut in Drosophila, so dass es eines der besten Modellsysteme, die Funktion von Genen, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse zu untersuchen. Binäre Expressionssysteme wie Hefe Gal4/UAS (upstream Aktivierung Sequenz), wurde zuerst angenommen, für gewebespezifischen Enhancer Trapping und gen Misexpression in Drosophila genetischen Modell¹ (Abbildung 1). Dieses System erleichtert die Entwicklung einer Vielzahl von Techniken wie räumlich-zeitliche Regelung der Überexpression des Gens, Misexpression, ko in ausgewählten Gruppen von Zellen als auch in Zelle Ablation, Zelle markieren, live Verfolgung der zellulären und molekularen Prozesse im Embryo und Gewebe, Linie nachzeichnen und Mosaik Analysen während der Entwicklung. Eine Reihe von binären Transkription System, z. B. bakterielle LexA/LexA_Op -System (Abbildung 1) und Neurospora Q-System, sind genetische Werkzeuge, die jetzt häufig in Drosophila, zusätzlich zu das ursprüngliche Gal4/UAS-System für gezielte Gen Ausdruck^1,2,3.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode um hochzuverlässige gewebespezifischen binäre Expressionssystems zu erzeugen, durch den Einsatz einer Genom-Bearbeitung Technik. Die jüngsten Fortschritte in der CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung Technologie konnten nie da gewesene Möglichkeiten gerichtete Genom Änderungen in einer Vielzahl von Organismen. Im Vergleich zu den anderen verfügbaren Genom Schnitttechniken, ist das CRISPR/Cas9-System Kostengünstig, effizient und zuverlässig. Diese Technologie nutzt Komponenten des adaptiven Immunsystems bakterielle: ein Cas9 Endonuklease Streptococcus Pyogenes , die eine Doppel-Strang-Pause (DSB) erstellt und eine Chimäre Reiseführer RNA (gRNA), der die Cas9 führt zu einer bestimmten Genom-Website für gezielte DSB⁴. Die Zellen enthalten die Maschinen um die DSB über verschiedene Wege zu reparieren. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) führt zu kleinen Einfügungen oder Löschungen Genfunktion, zu stören, während unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) einen definierten gerichtet/wünschenswert genomischen Knock-in/Knock-out führt durch eine exogene HDR-Spender als Vorlage verwenden. Die HDR-basierte Strategie kann effizient genutzt werden, um eine äußerst zuverlässige gewebespezifischen binärer Ausdruck System zu erzeugen, die die Grenzen der traditionellen Enhancer-Trap-Methoden überwinden können. Wir beschreiben eine schrittweise Anleitung zur Nutzung der CRISPR/Cas9-basierte HDR Reparatur bei der Erzeugung einer binären Transkription Treiber-Linie, die unter der Kontrolle der endogenen transkriptionellen und posttranskriptionelle Verordnung von einem Drosophila ausgedrückt wird gen. In diesem Protokoll zeigen wir die Generation einer Fahrer-Linie speziell für astlosen (Bnl) Gen Kodierung eine Familie FGF-Protein, das verzweigte Morphogenese von trachealen Atemwege Epithel⁵regelt. In diesem Beispiel das erste kodierende Exon des Gens Bnl wurde ersetzt durch die Folge einer bakteriellen LexA transaktivator Sequenz unbeschadet einer endogenen Cis-regulatorischen Sequenzen des Bnl -Gens. Wir zeigen, dass die Strategie eine Bnl-LexA Fahrer Linie erzeugt, die raumzeitlich den Ausdruck ein Reportergen platziert hinter der LexAoperator (LexAop oder LexO) ausschließlich in Bnl steuert- mit dem Ausdruck epitheliale/Mesenchymale/neuronalen Zellen.