Une stratégie efficace pour générer des systèmes de Transcription binaire spécifique des tissus chez la drosophile par modification du génome

La boîte à outils génétique pour l’expression des gènes ciblés a été bien développé chez la drosophile, ce qui en fait l’un des meilleurs systèmes de modèle pour étudier la fonction des gènes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires. Systèmes d’expression binaire, telles que la levure Gal4/UAS (séquence activatrice en amont), a été adopté pour les études de piégeage et gène exhausteur de tissu-spécifiques dans la drosophile modèle génétique¹ (Figure 1). Ce système a facilité l’élaboration d’un grand nombre de techniques telles que le règlement spatio-temporelle de la surexpression du gène, études, knockout dans certains groupes de cellules ainsi que dans l’ablation de la cellule, marquage cellulaire, traçage direct du cellulaire et moléculaire processus en embryon et tissus, suivi de lignée et analyses de mosaïque au cours du développement. Un certain nombre de système de transcription binaires, tels que les bactéries LexA/LexA_op système (Figure 1) et Q-système de Neurospora , sont de puissants outils génétiques qui sont maintenant largement utilisés chez la drosophile, en plus de le système de Gal4/UAS original pour l’expression de gène ciblé pour^1,2,3.

Nous présentons ici une méthode pour générer le système très fiable expression binaire spécifique des tissus en employant une technique de modification du génome. Les progrès récents dans la technologie d’édition CRISPR/Cas9 génome ont permis des possibilités sans précédent apporter des modifications du génome dirigée dans un large éventail d’organismes. Par rapport aux autres techniques de modification du génome disponible, le système CRISPR/Cas9 est peu coûteux, efficace et fiable. Cette technologie utilise des composants du système immunitaire adaptatif bactérien : une endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes qui crée une pause bicaténaires (DSB) et un ARN chimérique guide (gRNA), qui guide le Cas9 à un site particulier génome pour ORD ciblée⁴. Les cellules contiennent la machinerie pour réparer l’ORD en utilisant différentes voies. Fin non homologue rejoindre (NHEJ) conduit à petites insertions ou suppressions de perturber la fonction du gène, alors que la réparation axés sur l’homologie (HDR) introduit un défini réalisé/recherchées génomique dans/knock-knock-out par une donneuse HDR exogène en utilisant comme modèle. La stratégie de remplacement axés sur le HDR peut être efficacement utilisée pour générer un système hautement fiable expression binaire spécifique des tissus qui peut surmonter toutes les limites des méthodes traditionnelles enhancer trap. Nous décrivons une procédure pas à pas pour une utilisation de réparation de base CRISPR/Cas9 HDR dans la production d’une ligne pilote binaire de transcription qui s’exprime sous le contrôle d’endogène régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle d’un Drosophila gène. Dans ce protocole, nous démontrons la génération d’une ligne pilote spécifique pour dépourvu de branches (bnl) gène codant pour une protéine de famille FGF qui réglemente la morphogenèse ramification de trachéale bronchique épithélium⁵. Dans cet exemple, le premier codage exon du gène bnl a été remplacé par l’enchaînement d’une séquence de transactivateur LexA bactérienne sans altérer toute endogène cis-séquences régulatrices du gène bnl . Nous montrons que la stratégie a généré une ligne pilote de bnl-LexA spatio-temporelle contrôle l’expression d’un gène rapporteur placé en aval de LexAoperator (LexAop ou LexO) exclusivement dans bnl- cellules épithéliales/mésenchymateuses/neuronales exprimant.