Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

De genetische toolbox voor gerichte genexpressie is in Drosophila, waardoor het een van de beste modelsystemen te onderzoeken van de functie van genen die betrokken zijn in een breed scala van cellulaire processen goed ontwikkeld. Binaire expressiesystemen, zoals gist Gal4/UAS (upstream activering sequence), werd aangenomen voor weefsel-specifieke enhancer overlapping en gene misexpression in de Drosophila genetische model¹ (Figuur 1). Dit systeem vergemakkelijkt de ontwikkeling van een groot aantal technieken zoals Spatio verordening overexpressie van het gen, misexpression, knock-out in geselecteerde groepen cellen zo goed zoals in cel ablatie, cel markering, live traceren van cellulaire en moleculaire processen in het embryo en weefsels, lineage tracering en mozaïek analyses tijdens de ontwikkeling. Een aantal binaire transcriptie systeem, zoals de bacteriële LexA/LexA_op systeem (Figuur 1) en Neurospora Q-systeem, zijn krachtige genetische hulpmiddelen die worden nu algemeen gebruikt in Drosophila, in aanvulling op het oorspronkelijke Gal4/UAS systeem voor gerichte gene expression^1,2,3.

Hier presenteren we een methode voor het genereren van zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie systemen door gebruik te maken van een genoom-bewerken-techniek. De recente vooruitgang in CRISPR/Cas9 genoom bewerken technologie hebben toegestaan ongekende mogelijkheden gestuurde genoom wijzigingen aanbrengen in een brede waaier van organismen. In vergelijking met de andere beschikbare genoom-bewerkingstechnieken, is het CRISPR/Cas9-systeem goedkoop, efficiënt en betrouwbaar. Deze technologie maakt gebruik van onderdelen van het bacteriële adaptieve immuunsysteem: een Cas9 endonuclease van Streptococcus pyogenes die creëert een dubbel-strand break (DSB), en een chimeer gids-RNA (gRNA), die de Cas9 aan een bepaalde genoom site voor gidsen gerichte DSB⁴. De cellen bevatten de machine om te herstellen van de DSB met verschillende routes. Non-homologe einde deelname aan (NHEJ) leidt tot kleine invoegingen of verwijderingen verstoren genfunctie, terwijl homologie geleide reparatie (HDR) een gedefinieerde regie/wenselijk genomic knock-in/knock-out introduceert met behulp van een exogene HDR donor als een sjabloon. De vervanging HDR gebaseerde strategie kan efficiënt worden gebruikt voor het genereren van een zeer betrouwbare weefsel toepassingsspecifieke binaire expressie-systeem, dat alle beperkingen van de traditionele enhancer val methoden kan overwinnen. We beschrijven een stapsgewijze procedure voor het gebruik van CRISPR/Cas9 gebaseerde HDR reparatie bij het genereren van een binaire transcriptie driver regel die onder de controle van endogene verordening op het gebied van transcriptionele en post-transcriptional van een Drosophila wordt uitgedrukt gen. In dit protocol, tonen we de generatie van een driver regel specifiek voor branchless (bnl) gen een FGF familie eiwit dat vertakkende morfogenese van tracheale airway epitheel^{5 regelt}codering. In dit voorbeeld wordt de eerste codering exon van de bnl -gen werd vervangen door een opeenvolging van een bacteriële LexA transactivator reeks zonder te veranderen van een endogene cis-regulerende sequenties van de bnl -gen. We laten zien dat de strategie een bnl-LexA driver regel die spatiotemporally de expressie van een gen van de verslaggever geplaatst stroomafwaarts van LexAoperator (LexAop of LexO) uitsluitend in bnl regelt- gegenereerd epitheliale/mesenchymale/neuronale cellen uiten.