استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم
Summary
نقدم هنا، وسيلة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بالاستعاضة عن إكسون الترميز الأول من الجينات مع برامج النسخ. الأسلوب كريسبر/Cas9-تعتمد يضع تسلسل ترانساكتيفاتور تحت تنظيم الجين حل محل الذاتية، ويسهل التعبير ترانسكتيفاتور حصرا في أنماط الزمانية المكانية الخاصة بالجينات وبالتالي.
Abstract
نظم النسخ ثنائي أدوات قوية الوراثية المستخدمة على نطاق واسع لتصور، والتلاعب بالخلية التعبير مصير والجينات في مجموعات محددة من الخلايا أو الأنسجة في الكائنات نموذج. هذه النظم تحتوي على عنصرين هما كخطوط منفصلة وراثيا. سطر برنامج تشغيل يعرب منشط النسخي تحت السيطرة من الأنسجة على حدة المروجين/القدرة على، ومرافئ خط مراسل/المستجيب جين المستهدف وضع مجرى النهر إلى موقع ربط المنشط النسخ. حمل الحيوانات التي تأوي كل من مكونات ترانساكتيفيشن الخاصة بالانسجة لتعبير الجينات المستهدفة. دقة التعبير الزمانية المكانية للجينات في الأنسجة المستهدفة حاسمة بالنسبة لتفسير غير متحيز لنشاط الخلية/الجينات. ولذلك، وضع أسلوب لتوليد خطوط الحصرية الخاصة بخلية/الأنسجة سائق ضروري. هنا نقدم طريقة لإنشاء نظام التعبير العالية الخاصة بالانسجة المستهدفة باستخدام “متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب تكرار/كريسبر-المرتبطة” (كريسبر/Cas)-على أساس الجينوم تحرير الأسلوب. في هذا الأسلوب، دليل اندونوكليسي ويستهدف Cas9 اثنين تشيميريك الكشف (جرنة) إلى مواقع محددة في إكسون الترميز الأول للجينات في الجينوم المورفولوجية لإنشاء فواصل مزدوجة-ستراند (جهاز تسوية المنازعات). فيما بعد، باستخدام بلازميد مانحة خارجية تحتوي على تسلسل ترانساكتيفاتور، آلات إصلاح الخلية ذاتية تمكن الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من جهاز تسوية المنازعات، مما يؤدي إلى الحذف الدقيق واستبدال إكسون مع ترانساكتيفاتور التسلسل. وأعرب عن ترانساكتيفاتور طرقت في حصرا في الخلايا حيث رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية لاستبدال الجينات الوظيفية. البروتوكول خطوة بخطوة مفصلة تقدم هنا لتوليد سائق النسخي ثنائي المعرب عنها في صندوق الأجيال القادمة المورفولوجية/فروعها-إنتاج الخلايا الظهارية/العصبية يمكن اعتمادها لأي تعبير الجينات أو أنسجة محددة.
Introduction
الأدوات الجينية للجينات المستهدفة قد وضعت أيضا في المورفولوجية، يجعلها واحدة من أفضل أنظمة نموذجية للتحقيق في وظيفة الجينات المشاركة في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. نظم ثنائية التعبير، مثل الخميرة Gal4/UAS (التسلسل التنشيط المنبع)، اعتمد أولاً للأنسجة على حدة محسن ميسيكسبريشن الملائمة والجينات في نموذج الجينية المورفولوجية 1 (الشكل 1). هذا النظام على تيسير تطوير عدد كبير من تقنيات مثل تنظيم الزمانية المكانية overexpression الجينات، ميسيكسبريشن، وخروج المغلوب في مجموعات محددة من الخلايا، وكذلك كما هو الحال في خلية التذرية، ووسم الخلية، واقتفاء أثر مباشر الخلوية والجزيئية العمليات في الأجنة والأنسجة وتتبع النسب والتحليلات فسيفساء أثناء التطوير. عدد من النسخ ثنائي النظام، مثل البكتيريا ليزا نيوروسبورا س-نظام، ونظامليزاالبروتوكول الاختياري (الشكل 1) هي أدوات قوية الجينية التي تستخدم الآن على نطاق واسع في المورفولوجية، بالإضافة إلى نظام Gal4/UAS الأصلي للجينات المستهدفة التعبير1،،من23.
وهنا نقدم طريقة لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي التعبير باستخدام أسلوب التحرير الجينوم. التطورات الأخيرة في كريسبر/Cas9 الجينوم تكنولوجيا تحرير أتاحت فرصاً غير مسبوقة لإجراء تغييرات جينوم الموجهة في طائفة واسعة من الكائنات الحية. بالمقارنة مع التقنيات المتاحة الجينوم التحرير الأخرى، نظام كريسبر/Cas9 رخيصة وفعالة وموثوق بها. وتستخدم هذه التكنولوجيا مكونات الجهاز المناعي التكيفي البكتيرية: اندونوكليسي Cas9 العقدية المقيّحة يقوم بإنشاء فاصل مزدوج-ستراند (جهاز تسوية المنازعات)، ودليل تشيميريك رنا (جرنة)، التي توجه Cas9 لموقع معين جينوم ل جهاز تسوية المنازعات المستهدفة4. الخلايا تحتوي على إليه لإصلاح جهاز تسوية المنازعات باستخدام مسارات مختلفة. نهاية مثلى عدم الالتحاق بالعمل (نج) يؤدي إلى الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف لتعطيل وظيفة الجينات، وحين يدخل الإصلاح الموجه من التماثل (HDR) من معرفة الموجهة/مرغوب فيه الجينوم تدق-في/المغلوب باستخدام جهة مانحة خارجية في تقرير التنمية البشرية كقالب. كفاءة يمكن أن تستخدم استراتيجية استبدال المستندة إلى تقرير التنمية البشرية لإنشاء نظام موثوق بها للغاية الخاصة بالانسجة ثنائي تعبير، التي يمكن التغلب على جميع القيود المفروضة على أساليب فخ محسن التقليدية. يصف لنا إجراء خطوة بخطوة للاستفادة إصلاح HDR كريسبر/Cas9-تعتمد في توليد خط نسخ ثنائي برنامج تشغيل التي يتم التعبير عنها تحت سيطرة الذاتية تنظيم النسخي وبوستترانسكريبشونال المورفولوجية الجينات. في هذا البروتوكول، ونظهر توليد خط برنامج تشغيل محدد فروعها (bnl) الجينات ترميز بروتين أسرة صندوق الأجيال القادمة الذي ينظم morphogenesis المتفرعة من مجرى الهواء الرغامى ظهارة5. في هذا المثال، استعيض إكسون الترميز الأول من الجينات bnl تسلسل تسلسل ترانساكتيفاتور ليزا البكتيرية دون تغيير أي الذاتية رابطة الدول المستقلة-تسلسل الجين bnl التنظيمية. نظهر أن الاستراتيجية التي تم إنشاؤها بخط سائق bnl-ليزا سباتيوتيمبورالي يتحكم في التعبير عن الجينات مراسل وضعت المتلقين للمعلومات من ليكساوبيراتور (ليكساوب أو لكسو) حصرا في bnl- وإذ تعرب عن الخلايا الظهارية/الوسيطة/العصبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقليديا، تم إنشاؤها المورفولوجية محسن الفخاخ بطريقتين مختلفتين. واحدة من الطرق تشمل الإدراج عشوائي من برنامج التشغيل (على سبيل المثال.، Gal4) تسلسل جينوم بتبديل (مثلاً.، تبديل عنصر P)1 . بدلاً من ذلك، يمكن وضع تسلسل سائق تحت سيطرة منطقة محسن/المروج المفترضة في بناء ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور ف. منفذ والدكتور ك. أوكونور-جايلز الدكتور س. فنغ للمناقشات بشأن الاستراتيجية كريسبر؛ الدكتور يد كورنبرغ، ومركز الأسهم بلومينغتون الكواشف؛ الخفة في التصوير المرافق الأساسية؛ وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة: R00HL114867 و R35GM124878 بريال.
Materials
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10%SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O’Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Current Protocols in Molecular Biology. 111 (1), (2015).
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -. T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -. C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
