التوصيف الفيزيائي عالي الاستبانة للجسيمات النانوية المعدنية المفردة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموعات الأكسجين المعدنية المنفصلة، polyoxometalates (POMs)، عند حد جزيء واحد باستخدام منصة إلكترونية البيولوجية المستندة إلى nanopore. وتوفر هذه الطريقة نهجا ً تكميلياً لأدوات الكيمياء التحليلية التقليدية المستخدمة في دراسة هذه الجزيئات.
Abstract
يمكن الكشف عن الجزيئات الفردية وتتميز بقياس الدرجة التي تقلل من التيار الأيوني المتدفق من خلال مسام واحد على نطاق نانومتر. الإشارة هي سمة من خصائص الجزيء الفيزيائية الكيميائية وتفاعلاتها مع المسام. نحن نثبت أن النانوبور التي شكلتها البروتين البكتيري اكسوتوكسين المكورات العنقودية أوريوس ألفا الهيموليسين (αHL) يمكن الكشف عن polyoxometalates (POMs، مجموعات الأكسجين المعدني الأنيونية)، في حد جزيء واحد. وعلاوة على ذلك، يتم قياس منتجات التحلل متعددة من 12-phosphotungstic حمض POM (PTA، H3PW12O40)في الحل في وقت واحد. تسمح حساسية جزيء واحد من طريقة nanopore لPOMs أن تتميز بتركيزات أقل بكثير مما هو مطلوب للمطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR). هذه التقنية يمكن أن تكون بمثابة أداة جديدة للكيميائيين لدراسة الخصائص الجزيئية للبوليوكسوميتالاتس أو غيرها من المجموعات المعدنية، لفهم أفضل العمليات الاصطناعية POM، وربما تحسين غلتهم. من الناحية الافتراضية، يمكن التحقيق في موقع ذرة معينة، أو دوران جزء في الجزيء، وحالة أكسدة المعادن مع هذه الطريقة. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية الجديدة لديها ميزة السماح لرصد في الوقت الحقيقي من الجزيئات في الحل.
Introduction
ويمكن إجراء الكشف عن الأناليت الجزيئية الحيوية على مستوى جزيء واحد باستخدام المسام النانوية وقياس التعديلات الحالية الأيونية. عادة، يتم تقسيم المسام النانوية إلى فئتين على أساس تصنيعها: البيولوجية(تجميعها ذاتيا من البروتين أو الحمض النووي اوريغامي) 1،2،3،أو الحالة الصلبة (على سبيلالمثال،المصنعة مع أدوات معالجةأشباه الموصلات) 4،5. في حين اقترح المسام النانوية ذات الحالة الصلبة على أنها أكثر قوة من الناحية المادية ويمكن استخدامها على مدى مجموعة واسعة من شروط الحل، فإن المسام النانوية البروتينية توفر حتى الآن حساسية أكبر، وأكثر مقاومة للقاذورات، وعرض نطاق ترددي أكبر، ومادة كيميائية أفضل الانتقائية، وإشارة أكبر إلى نسبة الضوضاء.
مجموعة متنوعة من قنوات الأيونات البروتينية، مثل تلك التي شكلتها المكوراتالعنقودية العضوية الانحلالية (αHL)، يمكن استخدامها للكشف عن جزيئات واحدة، بما في ذلك الأيونات (على سبيلالمثال، H+ و D+ )2،3، polynucleotides (DNA وRNA)6،7،8، الحمض النووي التالف9، الببتيدات10، البروتينات (مطوية وتكشفت)11، البوليمرات (البولي ايثيلين غليكول وغيرها)12،13 , 14، الجسيمات النانوية الذهب15،16،17،18،19، وغيرها من الجزيئات الاصطناعية20.
لقد أثبتنا مؤخرًا أن nanopore αHL يمكن أيضاً بسهولة الكشف عن المجموعات المعدنية وتوصيفها، وpolyoxometalates (POMs)، على مستوى جزيء واحد. POMs هي منفصلة nanoscale مجموعات الأكسجين المعدنية التي تم اكتشافها في 182621، ومنذ ذلك الحين ، تم تصنيع أنواع أخرى كثيرة. الأحجام المختلفة، والهياكل، والتراكيب عنصري من polyoxometalates التي تتوفر الآن أدى إلى مجموعة واسعة من الخصائص والتطبيقات بما في ذلك الكيمياء22،23، الحفز24، علوم المواد25 ،26، والبحوث الطبية الحيوية27،28،29.
توليف POM هو عملية التجميع الذاتي التي تنفذ عادة في الماء عن طريق خلط الكميات المطلوبة من الأملاح المعدنية الأحادية. وبمجرد تشكيلها، تظهر أجهزة الشراء تنوعًا كبيرًا في الأحجام والأشكال. على سبيل المثال، يتكون هيكل بوليانيون Keggin، XM12O40q- من واحد heteroatom (X) محاطة بأربعة أكسجين لتشكيل رباعي الأبعاد (س هو المسؤول). يقع الهيترواتوم مركزيا داخل قفص يتكون من 12 وحدات MO ثماني الأوثماني (حيث M = المعادن الانتقالية في حالة الأكسدة العالية)، والتي ترتبط ببعضها البعض من قبل ذرات الأكسجين المشتركة المجاورة. في حين التنغستن polyoxometalates هيكل مستقر في الظروف الحمضية، أيونات هيدروكسيد تؤدي إلى الانقسام المائي من المعادن والأكسجين (M-O) السندات30. وتسفر هذه العملية المعقدة عن فقدان وحدة فرعية واحدة أو أكثر من وحدات الأوكتانيد الثماني 6، مما يؤدي إلى تكوين أنواع أحادية الشاغرة وثلاثية الشاغرة، وفي نهاية المطاف إلى التحلل الكامل لوحدات إدارة الملوثات العضوية الثابتة. وسوف تقتصر مناقشتنا هنا على منتجات التحلل الجزئي من حمض فوسفيوالتنغستن 12 في درجة الحموضة 5.5 و 7.5.
والهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن مجموعات الأكسجين المعدنيالمنفصلة عند حد جزيء واحد باستخدام منصة إلكترونية بيولوجية تعتمد على النانوبور. يسمح هذا الأسلوب الكشف عن الكتل المعدنية في الحل. ويمكن التمييز بين الأنواع المتعددة في الحل بحساسية أكبر من الأساليب التحليلية التقليدية33. مع ذلك، يمكن توضيح الاختلافات الدقيقة في هيكل POM، وعند تركيزات أقل بشكل ملحوظ من تلك المطلوبة للمطياف NMR. والأهم من ذلك، يسمح هذا النهج حتى التمييز من أشكال الإيسومرية من Na8HPW9O341.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرًا لشحنتها الأنيونية، من المرجح أن ترتبط POMs بالكاتيونات المضادة العضوية من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية. ولذلك، من المهم تحديد ظروف الحل المناسبة وبيئات الكهارل المناسبة (وخاصة الموجبة في الحل) لتجنب تشكيل معقدة مع POMs. مطلوب عناية خاصة في اختيار المخزن المؤقت. على سبيل المثال، معدل ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للدعم المالي من المنظمة الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية للحصول على زمالة ما بعد الدكتوراه (إلى J.E.) ومنحة من المعهد الوطني للصحة البشرية (إلى J.J.K.). نحن نقدر مساعدة الأستاذين جينغيو جو وسيرجي كالاتشيكوف (جامعة كولومبيا) لتوفير heptameric αHL، وللمناقشات الملهمة مع البروفيسور جوزيف راينر (جامعة فرجينيا كومنولث).
Materials
| Nanopatch DC System | Electronic Biosciences, Inc., EBS | ||
| Millipore LC-PAK | Millipore vacuum filter | ||
| 1,2-Diphytanoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850356P | |
| Decane, ReagentPlus, ≥99%, | Sigma-Aldrich | D901 | |
| αHL | List Biological Laboratories, Campbell, CA | ||
| Ag wire | Alfa Aesar | ||
| 2 mm Ag/AgCl disk electrode | In Vivo Metric | E202 | |
| High-impedance amplifier system | Electronic Biosciences, San Diego, CA | ||
| quartz capillaries | |||
| custom polycarbonate test cell | |||
| Data Processing and Analysis MOSAIC | https://pages.nist.gov/mosaic/ | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 455970 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | 71507 |
References
- Ettedgui, J., Kasianowicz, J. J., Balijepalli, A. Single molecule discrimination of heteropolytungstates and their Isomers in solution with a nanometer-scale pore. Journal of the American Chemical Society. 138 (23), 7228-7231 (2016).
- Bezrukov, S., Kasianowicz, J. Current noise reveals protonation kinetics and number of ionizable sites in an open protein ion channel. Physical Review Letters. 70 (15), 2352-2355 (1993).
- Kasianowicz, J. J., Bezrukov, S. M. Protonation dynamics of the alpha-toxin ion channel from spectral analysis of pH-dependent current fluctuations. Biophysj. 69 (1), 94-105 (1995).
- Please, T. R., Ayub, M. Solid-State Nanopore. Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 121-140 (2013).
- Dekker, C. Solid-state nanopores. Nature Nanotechnology. 2 (4), 209-215 (2007).
- Kasianowicz, J. J., Brandin, E., Branton, D., Deamer, D. W. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13770-13773 (1996).
- Akeson, M., et al. Microsecond time-scale discrimination among polycytidylic acid, polyadenylic acid, and polyuridylic acid as homopolymers or as segments within single RNA molecules. Biophysical Journal. 77 (6), 3227-3233 (1999).
- Singer, A., Meller, A. Nanopore-based Sensing of Individual Nucleic Acid Complexes. Israel Journal of Chemistry. 49 (3-4), 323-331 (2010).
- Jin, Q., Fleming, A. M., Burrows, C. J., White, H. S. Unzipping kinetics of duplex DNA containing oxidized lesions in an α-hemolysin nanopore. Journal of the American Chemical Society. 134 (26), 11006-11011 (2012).
- Halverson, K. M., et al. Anthrax biosensor, protective antigen ion channel asymmetric blockade. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34056-34062 (2005).
- Oukhaled, G., et al. Unfolding of proteins and long transient conformations detected by single nanopore recording. Physical Review Letters. 98 (15), 158101 (2007).
- Reiner, J. E., Kasianowicz, J. J., Nablo, B. J., Robertson, J. W. F. Theory for polymer analysis using nanopore-based single-molecule mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12080-12085 (2010).
- Robertson, J. W. F., et al. Single-molecule mass spectrometry in solution using a solitary nanopore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (20), 8207-8211 (2007).
- Baaken, G., Ankri, N., Schuler, A. -. K., Rühe, J., Behrends, J. C. Nanopore-based single-molecule mass spectrometry on a lipid membrane microarray. ACS Nano. 5 (10), 8080-8088 (2011).
- Angevine, C. E., Chavis, A. E., Kothalawala, N., Dass, A., Reiner, J. E. Enhanced single molecule mass spectrometry via charged metallic clusters. Analytical Chemistry. 86 (22), 11077-11085 (2014).
- Astier, Y., Uzun, O., Stellacci, F. Electrophysiological study of single gold nanoparticle/alpha-Hemolysin complex formation: a nanotool to slow down ssDNA through the alpha-Hemolysin nanopore. Small. 5 (11), 1273-1278 (2009).
- Chavis, A. E., Brady, K. T., Kothalawala, N., Reiner, J. E. Voltage and blockade state optimization of cluster-enhanced nanopore spectrometry. Analyst. 140 (22), 7718-7725 (2015).
- Campos, E., et al. Sensing single mixed-monolayer protected gold nanoparticles by the α-hemolysin nanopore. Analytical Chemistry. 85 (21), 10149-10158 (2013).
- Campos, E., et al. The role of Lys147 in the interaction between MPSA-gold nanoparticles and the α-hemolysin nanopore. Langmuir. 28 (44), 15643-15650 (2012).
- Baaken, G., et al. High-Resolution Size-Discrimination of Single Nonionic Synthetic Polymers with a Highly Charged Biological Nanopore. ACS Nano. 9 (6), 6443-6449 (2015).
- Berzelius, J. J. Beitrag zur näheren Kenntniss des Molybdäns. Annalen Der Physik. 82 (1), 369-392 (1826).
- Long, D. -. L., Burkholder, E., Cronin, L. Polyoxometalate clusters, nanostructures and materials: from self assembly to designer materials and devices. Chemical Society Reviews. 36 (1), 105-121 (2007).
- Muller, A., et al. Polyoxovanadates: High-nuclearity spin clusters with interesting host-guest systems and different electron populations. Synthesis, spin organization, magnetochemistry, and spectroscopic studies. Inorganic Chemistry. 36 (23), 5239-5250 (1997).
- Rausch, B., Symes, M. D., Chisholm, G., Cronin, L. Decoupled catalytic hydrogen evolution from a molecular metal oxide redox mediator in water splitting. Science. 345 (6202), 1326-1330 (2014).
- Dolbecq, A., Dumas, E., Mayer, C. R., Mialane, P. Hybrid organic-inorganic polyoxometalate compounds: from structural diversity to applications. Chemical Reviews. 110 (10), 6009-6048 (2010).
- Busche, C., et al. Design and fabrication of memory devices based on nanoscale polyoxometalate clusters. Nature. 515 (7528), 545-549 (2014).
- Pope, M., Müller, A. . Polyoxometalates: From Platonic Solids to Anti-Retroviral Activity. 10, (2012).
- Rhule, J. T., Hill, C. L., Judd, D. A., Schinazi, R. F. Polyoxometalates in medicine. Chemical Reviews. 98 (1), 327-358 (1998).
- Gao, N., et al. Transition-metal-substituted polyoxometalate derivatives as functional anti-amyloid agents for Alzheimer’s disease. Nature Communications. 5, 3422 (2014).
- Pope, M. T. . Heteropoly and Isopoly Oxometalates. 8, (1983).
- Braha, O., et al. Designed protein pores as components for biosensors. Chemistry & Biology. 4 (7), 497-505 (1997).
- Forstater, J. H., et al. MOSAIC: A modular single-molecule analysis interface for decoding multistate nanopore data. Analytical Chemistry. 88 (23), 11900-11907 (2016).
- Balijepalli, A., et al. Quantifying Short-Lived Events in Multistate Ionic Current Measurements. ACS Nano. 8, 1547-1553 (2014).
- Misakian, M. M., Kasianowicz, J. J. J. Electrostatic influence on ion transport through the alphaHL channel. Journal of Membrane Biology. 195 (3), 137-146 (2003).
- Piguet, F., et al. Identification of single amino acid differences in uniformly charged homopolymeric peptides with aerolysin nanopore. Nature Communication. 9 (966), (2018).
