Создание гомо - и Heterografts между арбуз и бутылка тыквы для изучения холодной отзывчивым микроРНК
Summary
Здесь мы представляем подробный протокол для эффективно гомо – и heterografts между арбуз и бутылка тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных, для расследования холодной отзывчивым микроРНК.
Abstract
МикроРНК (интерферирующим) эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt, известно, играют важную роль в развитии растений и адаптации. Существует накапливая доказательства того, что выражения некоторых интерферирующим изменяются при прививке, сельскохозяйственной практики, обычно используется фермерами для улучшения урожая толерантности к биотическим и абиотическим стрессовым. Бутылка тыквы является по своей сути Климат эластичные культур, по сравнению с много других крупных тыквенных, включая арбуз, что делает его одним из наиболее широко используемых Подвои для последнего. Недавнее развитие высокопроизводительного секвенирования технологий предоставляет большие возможности для изучения холодной гибкой адаптивной и их вклад в heterograft преимущества; Тем не менее соответствующие экспериментальные процедуры являются предпосылкой для этой цели. Здесь мы представляем подробный протокол для эффективного создания гомо – и heterografts между холодной чувствительными арбуз и холодной терпимо бутылки тыквы, помимо методов выборки ткани, генерации данных и анализа данных. Представленные методы полезны также для других систем, Прививка растений, допросить Мирна положениям различных экологических стрессов, например тепла, засухи и солености.
Introduction
Прививки давно работал как сельскохозяйственной техники для улучшения производства сельскохозяйственных культур и терпимости к биотическим и абиотическим стрессовым1,2,3. В heterografting системах Элитная Подвои может укрепить поглощению воды и питательных веществ растений, усилить сопротивление почвенными патогеннами и ограничить негативные последствия металла токсичности4,5, который может наделять графтов расширение силой роста и повышения терпимости к экологическим стрессам. Во многих случаях heterografting также может повлиять на плод качества в садовых растений, приводит к улучшению фруктовый аромат и повышенное содержание соединений здравоохранения6,7. Было установлено, что дальней передачи фитогормонов, РНК, пептидов и белков между подвоя и scion является основной механизм плавного роста и развития перепрограммирования scion растений8,9 ,10. Прививка широко используется в исследованиях дальнего сигнализации и транспорта по отношению к экологической адаптации11. Прививочных экспериментов особенно сильны для однозначной обнаружения передаваемых молекул в получении ткани или сосудистая sap и активация или подавление молекулярных целей из-за сигнала передачи12.
Non кодирования РНК, большой класс РНК, которые оказывают важные функции регулирования в клетках, поступили играть определенную роль в содействии адаптации растений к абиотическим стрессом13. интерферирующим эндогенные малые некодирующих RNAs около 20-24 nt. исследования показали регулирующей роли интерферирующим в различных аспектах деятельности предприятия, такие как стрелять роста, боковые корень формирования14,,1516, поглощение питательных веществ, сульфат метаболизм и гомеостаза17и ответы к биотическим и абиотическим подчеркнуть18. Недавно выражение адаптивной и их генов-мишеней были связаны с солью стрессу в heterografted огурец саженцы19. В intervariety графтов винограда ответы Мирна выражения к стрессу засухи были найдены в зависимости от генотипа20.
Быстрое развитие и снижение стоимости технологии высокопроизводительного секвенирования предоставили прекрасную возможность для изучения правил микроРНК в агрономической растений. Арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), важный cucurbit культур, выращенных в мире, чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] (Standl.) является более устойчивыми климата cucurbit обычно используется фермерами для графт с арбузом. Основной целью настоящего исследования является разработать стандарт, эффективный и удобный метод для изготовления heterografts между арбуз (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) и бутылка тыквы (лагенария siceraria [Молина] Standl). Этот протокол также обеспечивает подробный экспериментальной схемы и аналитических процедур для изучения регуляции Мирна выражений после прививки, что полезно для выявления механизмов лежащих в основе heterografting преимущества.
Завод материалов, используемых в настоящем исследовании включают арбуз сорт и Ландрас бутылка тыквы. Арбуз сорт является коммерческий сорт с высокой урожайностью, но чувствительны к низким температурам. Бутылка тыквы ландрас-это популярный Подвой для прививки с арбузом, огурец и бутылка тыквы, из-за его прекрасную терпимости низких температурах21.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе мы подробно описал высокоэффективной и воспроизводимый метод, чтобы сделать гомо – и heterografts между арбуз и бутылка тыквы. Этот метод, требующий никакого конкретного оборудования, очень прост в эксплуатации и обычно имеет очень высокую выживаемость приживления. Метод мо?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (31772191), исследовательский проект для общественный интерес в провинции Чжэцзян (2017C 32027), ключ науки проект по селекции растений в Чжэцзян (2016C 02051) и национальной программы Поддержка первоклассных молодых специалистов (п).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
