Generazione di omo - e Heterografts tra anguria e zucca bottiglia per lo studio dei microRNA freddo-sensible a reagire
Summary
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per fare in modo efficiente omo – e heterografts tra anguria e zucca bottiglia, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati, per l’indagine dei microRNA freddo-sensible a reagire.
Abstract
I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 endogeni nt, conosciuto per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di pianta e di adattamento. C’è un’evidenza accumula mostrando che le espressioni di alcuni miRNA sono alterate quando l’innesto, una pratica agricola comunemente utilizzata dagli agricoltori per migliorare la tolleranza delle colture agli stress biotici e abiotici. Zucca del Pellegrino è una coltura intrinsecamente clima-resiliente rispetto a molte altre cucurbitacee principali, tra cui anguria, rendendolo uno dei portinnesti più ampiamente usati per quest’ultimo. Il recente progresso delle tecnologie di sequenziamento ad alte prestazioni ha fornito grandi opportunità per indagare Mirna freddo-sensible a reagire e i loro contributi ai vantaggi heterograft; Eppure, adeguate procedure sperimentali sono un prerequisito per questo scopo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione efficiente di omo – e heterografts tra l’anguria fredda-sensibili e la zucca bottiglia fredda-tollerante, oltre ai metodi di campionamento del tessuto, generazione di dati e analisi dei dati. I metodi presentati sono anche utili per altri sistemi di impianto-innesto, per interrogare miRNA regolamenti sotto vari stress ambientali, quali calore, siccità e salinità.
Introduction
L’innesto è stato impiegato a lungo come una tecnica agricola per migliorare la produzione vegetale e la tolleranza agli stress biotici e abiotici1,2,3. Nei sistemi heterografting, portinnesti d’eliti possono migliorare l’assorbimento di acqua e sostanze nutritive delle piante, rafforzare la resistenza ai patogeni del suolo e limitare gli effetti negativi della tossicità del metallo4,5, che possono conferire una maggiore gli innesti vigore di crescita e una maggiore tolleranza agli stress ambientali. In molti casi, heterografting possono avere un impatto anche qualità di frutta in piante orticole, che conduce al sapore di frutta migliorata e maggiore contenuto di composti correlati con la salute6,7. È stato trovato che il trasferimento a lunga distanza di fitormoni, RNAs, peptidi e proteine fra il portinnesto e la marza è un meccanismo fondamentale modulando la crescita e lo sviluppo riprogrammazione di scion piante8,9 ,10. L’innesto è stato ampiamente usato negli studi di segnalazione a lunga distanza e trasporto in relazione di adattamento ambientale11. Esperimenti di innesto sono particolarmente potenti per inequivocabile rivelazione di molecole trasmesse nella ricezione del tessuto o vascolare sap e l’attivazione o soppressione di bersagli molecolari a causa di segnale trasmissione12.
RNA non-codificanti, una grande classe di RNA che esercitano importanti funzioni di regolamentazione in cellule, è stati segnalati a giocare un ruolo nel facilitare l’adattamento della pianta a stress abiotici13. i miRNA sono endogeni di piccoli RNA non codificanti di circa 20-24 nt. studi hanno rivelato il ruolo regolatore dei miRNA nei vari aspetti dell’attività degli impianti, così come sparare crescita, laterale radice formazione14,15,16, l’assorbimento di nutrienti, metabolismo di solfato e omeostasi17e risposte a stress biotici e abiotici stress18. Recentemente, l’espressione di Mirna e dei loro geni bersaglio sono stati collegati al sale tolleranza allo stress in piantine di cetriolo heterografted19. Negli innesti di intervariety di uva, le risposte dell’espressione dei miRNA a stress idrico sono state trovate per essere dipendente dal genotipo20.
Il rapido sviluppo e diminuendo il costo della tecnologia di sequenziamento ad alta velocità hanno fornito una grande opportunità per lo studio dei regolamenti di miRNA in piante agronomiche. Cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.), una coltura importante cucurbita in tutto il mondo, è sensibile alle basse temperature. Zucca del Pellegrino (siceraria Lagenaria [Molina] Standl.) è una cucurbita di resilienza del clima più comunemente utilizzata dagli agricoltori per l’innesto con l’anguria. L’obiettivo primario di questo studio è quello di stabilire uno standard, efficiente e conveniente metodo per rendere heterografts tra cocomero (Citrullus lanatus [Thunb.] Mansf.) e bottiglia zucca (siceraria Lagenaria [Molina] Standl). Questo protocollo prevede inoltre un dettagliato schema sperimentale e procedure analitiche per lo studio della regolazione di miRNA espressioni dopo l’innesto, che è utile per rivelare i meccanismi alla base di vantaggi heterografting.
I materiali vegetali utilizzati in questo studio includono la cultivar di anguria e la zucca bottiglia landrace. Cultivar di anguria è una cultivar commercio con alto rendimento ma sensibili alle basse temperature. Landrace bottiglia zucca è un portinnesto popolare per l’innesto con anguria, cetriolo e bottiglia zucca, grazie alla sua eccellente tolleranza di basse temperature21.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo descritto in dettaglio un metodo altamente efficace e riproducibile per rendere omo – e heterografts tra anguria e zucca del Pellegrino. Questo metodo, che richiedono senza attrezzature specifiche, è molto facile da usare e in genere ha un tasso di sopravvivenza molto alta di innesto. Il metodo è utilizzabile anche per fare innesti per altre cucurbitacee, come tra anguria, cetriolo e zucca.
Vale la pena notare che la dimensione relativa (età) del portainnesto e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (31772191), il progetto di ricerca di interesse pubblico nella provincia di Zhejiang (2017C 32027), la chiave scienza progetto di allevamento vegetale in Zhejiang (2016C 02051) e il programma nazionale per il supporto di prim’ordine giovani professionisti (per spaccio).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
