Yerelleştirmek için Autometallography ve yarı ölçmek gümüş deniz doku kullanımı
Summary
Bir iletişim kuralı tarafından autometallography Ag deniz karaciğer ve böbrek dokularda yerelleştirmek için sunulmaktadır. Ayrıca, deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) adında yeni bir tahlil bu dokuların Ag konsantrasyonlarda tahmin etmek için geliştirilmiştir.
Abstract
Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) ticari ürünleri, tekstil, kozmetik ve güçlü kendi antimikrobiyal etkileri nedeniyle sağlık öğeleri de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılmıştır. Ayrıca çevreye serbest bırakılması ve okyanusta birikir. Bu nedenle, AgNPs Ag kirlenme önemli kaynağıdır ve Ag çevre toksisite kamu bilincini artmaktadır. Önceki çalışmalarda Biyoakümülasyon (içinde üreticileri) ve AG (içinde tüketicilerin/avcılar) büyütme gösterdi. Deniz memelileri, okyanus, apex yırtıcı olumsuz Ag/Ag bileşikler tarafından etkilenmiş olabilir. Ag/Ag bileşikler deniz doku konsantrasyonları İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) tarafından ölçülebilir rağmen ICP-MS kullanımı yüksek sermaye maliyetini ve doku depolama/hazırlık gereksinimi ile sınırlıdır. Bu nedenle, bir autometallography (AMG) yöntemiyle kullanarak bir görüntü kantitatif analiz formalin sabit-parafin gömülü (FFPE) doku Ag dağıtım suborgan düzeyinde yerelleştirilmesine ve cetacean Ag konsantrasyon tahmin etmek için bir adjuvan yöntemi olabilir, doku. AMG olumlu sinyaller proksimal renal tübüler epitel, hepatositlerin ve Kupffer hücreleri sitoplazmada irili ufaklı siyah granül çoğunlukla kahverengidir. Zaman zaman, bazı amorf altın sarısı kahverengi AMG olumlu sinyallere lümen ve belirtilmiştir, bazı proksimal renal tübüllerin membran. Ag konsantrasyon tahmin etmek için tahlil Cetacean histolojik Ag tahlil (görüntü kantitatif analiz AMG yöntemi ve ICP-MS verilerden tarafından kurulan bir regresyon modeli olan CHAA), adı verilmiştir. AMG CHAA yerelleştirilmesine ve yarı ölçmek ağır metaller ile kullanımı spatio-zamansal ve türler arası araştırmaları için uygun bir yöntem sağlar.
Introduction
Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) ticari ürünleri, tekstil, kozmetik ve onların büyük antimikrobiyal etkileri1,2nedeniyle sağlık öğeleri de dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılmıştır. Bu nedenle, üretim AgNPs ve AgNP içeren ürün sayısı saat3,4üzerinde arttı. Ancak, AgNPs ortama serbest ve okyanus5,6‘ birikir. Ag kirlenme büyük kaynağı haline gelmiştir ve Ag çevre toksisite kamu bilincini artmaktadır.
AgNPs ve Ag deniz ortamında karmaşık ve sürekli değişen durumudur. Önceki çalışmalarda gibi parçacıklar, toplama, dağıtılması, farklı kimyasal türler ile tepki veya Ag+ iyonları7,8yeniden AgNPs kalabileceği belirttiler. Ag karışımları, AgCl gibi çeşitli nerede bentik organizmalar tarafından yutulur ve gıda zinciri9,10girin deniz çökeller içinde bulduk. Chi-ku lagün alanı Tayvan güneybatı kıyısı boyunca yapılan önceki bir araştırmaya göre son derece düşük ve kabuk bereket için benzer deniz çökeller Ag konsantrasyonları, ve bu balık karaciğer dokusunun genellikle algılama (< 0,025 μg/g ıslak/ıslak)11sınırlayın. Ancak, önceki çalışmalar farklı ülkede yapılan karaciğer nispeten yüksek Ag konsantrasyonda deniz memelileri12,13göstermiştir. Ve yunuslar karaciğerleri Ag konsantrasyon yaş Ag kaynak vücudunda büyük olasılıkla onların hayvanın avı12olduğunu düşündüren, bağımlıdır. Bu bulgular daha fazla Ag biomagnification yüksek trophic düzeyde hayvanlarda öneririz. Deniz memelileri, okyanusun içinde apex yırtıcı olarak Ag/Ag bileşikler12,13,14tarafından kaynaklanan olumsuz sağlık etkileri geçirmiş olabilir. En önemlisi, deniz memelileri gibi insanlar memeliler ve olumsuz sağlık etkileri deniz memelileri Ag/Ag bileşikler nedeniyle insanlarda da oluşabilir. Başka bir deyişle, deniz memelileri sentinel hayvanlar deniz çevre ve insan sağlığı için olabilir. Bu nedenle, sağlık üzerindeki etkileri, doku dağıtım ve deniz memelileri AG konsantrasyon büyük endişe vardır.
Ag/Ag bileşikler deniz doku konsantrasyonları İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi (ICP-MS) tarafından ölçülebilir rağmen ICP-MS kullanımı ile yüksek sermaye maliyeti (enstrüman ve bakım) ve doku muhafazası için gereksinimleri ile sınırlıdır /Preparation12,15. Buna ek olarak, tüm araştırmalarda lojistik zorluklar, insan gücü sıkıntısı ve ilgili kaynaklar12eksikliği nedeniyle telli deniz olguların kapsamlı doku örnekleri toplamak genellikle zordur. Donmuş doku örnekleri ICP-MS analizi için sınırlı soğutma alanı nedeniyle kolayca saklanmaz ve donmuş doku örnekleri kırık soğutma cihazları12nedeniyle iptal edilecek. Söz konusu bu engelleri araştırmalar kirlenme seviyeleri deniz dokulara göre ICP-MS analiz donmuş doku örnekleri kullanarak engel. Buna ek olarak, doku örnekleri sabit formalin ölü iplikçikli deniz memelileri Nekropsi sırasında toplamak nispeten kolay. Bu nedenle, algılama/deniz dokularda ağır metaller doku örnekleri sabit formalin kullanarak ölçü birimi için kullanımı kolay ve ucuz bir yöntem geliştirmek gereklidir.
Her ne kadar suborgan dağıtımları ve alkali ve toprak alkali metaller konsantrasyonları formalin sabit sırasında değişmiş olabilir, (FFPE) işlemi, sadece daha az etkileri gibi Ag, geçiş metaller üzerinde parafin gömülü kaydetti16olmuştur. Bu nedenle, FFPE doku metal yerelleştirme ve ölçümler16,17için ideal örnek kaynak olarak kabul edilmiştir. Autometallography (AMG), histochemical bir işlemi, Siyah AMG olumlu sinyallere FFPE doku bölümlerinde degisken ölçekli altın sarısı gibi ağır metaller yükseltmek ve güçlendirilmiş bu ağır metaller ışık mikroskobu18altında, görüntülenir 19 , 20 , 21. bu nedenle, AMG yöntemi ağır metaller suborgan dağıtımlarında bilgi sağlar. ICP-MS sadece ağır metaller organ düzey18konsantrasyon ölçebilirsiniz çünkü metabolik yollar ağır metallerin biyolojik sistemlerde eğitim için önemli ek bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, ImageJ gibi bir dijital görüntü analiz yazılımı histolojik dokusu bölümleri22,23kantitatif analiz için uygulanmıştır. Siyah AMG olumlu sinyallere FFPE doku bölümlerin degisken ölçekli altın sarısı sayılabilir ve ağır metaller konsantrasyonları tahmin etmek için kullanılan. Mutlak Ag konsantrasyon doğrudan görüntü kantitatif analiz AMG yöntemiyle tarafından tespit edilemez olsa da, bu görüntü kantitatif analiz ve ICP-MS, cetacean adlı elde edilen verilere dayalı bir regresyon modeli tarafından tahmin edilebilir histolojik Ag tahlil (CHAA). En zor durumdaki deniz memelileri analizde ICP-MS tarafından Ag konsantrasyonları ölçme zorlukları göz önüne alındığında, CHAA Ag konsantrasyonlarda ICP-MS analiz eksikliği nedeniyle tarafından tespit edilemez deniz dokularda tahmin etmek için bir değerli adjuvan yöntemdir dondurulmuş doku örnekleri. Bu kağıt Ag suborgan düzeyinde ve deniz memelileri karaciğer ve böbrek dokuların Ag konsantrasyonlarda tahmin etmek için CHAA adında bir tahlil yerelleştirme için histochemical tekniği (AMG yöntemi) protokolünü açıklar.
Şekil 1: Ag konsantrasyonları tahmin etmek için kurulması ve deniz histolojik Ag tahlil (CHAA) uygulanması gösteren akış şeması. CHAA deniz histolojik Ag tahlil FFPE = = Formalin sabit, parafin-gömülü, ICP-MS İndüktif Eşleşmiş Plazma kütle spektroskopisi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Makale çalışmada adjuvan yöntemi Ag dağılımın suborgan düzeyde ve Ag konsantrasyonlarda deniz dokularda tahmin etmek için kurmaktır. ICP-MS, 2) AMG analiz çiftiyle eşleşir doku örnekleri ile bilinen Ag konsantrasyonları, 3) Ag konsantrasyonları tahmin etmek için regresyon modeli (CHAA) kurulması tarafından deniz dokularda 1) Ag konsantrasyonları belirlenmesi geçerli iletişim kuralları içerir AMG pozitif değerler, 4 tarafından) değerlendirilmesi doğruluğu ve kesinliğini CHAA ve 5) Ag tahmini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tayvan Cetacean kalmasından ağı örnek toplama ve depolama, Taipei Tayvan Cetacean toplum da dahil için teşekkür ederiz; Deniz Araştırma Laboratuvarı (Prof. haciz-Siang Chou), Ekoloji Enstitüsü, Evrimsel biyoloji, Ulusal Tayvan Üniversitesi, Taipei; Doğa Bilimleri (Dr. Chiou-Ju Yao), Taichung Ulusal Müzesi; ve deniz biyolojisi ve Cetacean Araştırma Merkezi, Ulusal Cheng-Kung Üniversitesi. Biz de Ormancılık Bürosu, tarım Konseyi, İcra Yuan onların izni için teşekkür ederiz.
Materials
| HQ Silver enhancement kit | Nanoprobes | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Paraffin |
| 100% Ethanol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| Non-Xylene | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| Silane coated slide | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| Cover glass (25 x 50 mm) | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| Malinol | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM Haematoxylin Staining | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10% neutral buffered formalin solution | Chin I Pao Co., Ltd | — | |
| Tip (1000 μL) | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml Centrifuge Tube | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| Dogfish liver | National Research Council of Canada | DOLT-2 | |
| Dogfish muscle | National Research Council of Canada | DORM-2 | |
| Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) | PerkinElmer Inc. | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6 liter freeze dry system | Labconco | 7752030 | For freeze drying |
| BRAND® SILBERBRAND volumetric flask | Merck | Z326283 | |
| 30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure | Savillex Corporation | 200-030-12 | For diagestion |
| Nitric acid, superpur®, 65.0% | Merck | 1.00441 | For diagestion |
| Hot Plate/Stirrers | Corning® | PC-220 | For diagestion |
| High Shear lab mixer | Silverson | SL2T | For homogenization |
| Sterile polypropylene sample jar (250mL) | Thermo Scientific™ | 6186L05 | For homogenization |
| Digital camera | Nikon Corporation | DS-Fi2 | |
| Light microscope | Nikon Corporation | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome | Thermo Scientific™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome | Sakura | 1429 | |
| Microtome blade S35 | FEATHER® | 207500000 | |
| Slide staining dish and cover | Brain Research Laboratories | #3215 | |
| Steel staining rack | Brain Research Laboratories | #3003 | |
| Shandon embedding center | Thermo Scientific™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® tissue processor | Thermo Scientific™ | 69800003 | |
| Slide warmer | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| Water bath | Shandon Capshaw | 3964 | |
| Filter paper | Merck | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | Statistic software | |
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Stainless steel tissue embedding mould | Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd | RD-TBM003 | For paraffin emedding |
References
- McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
- Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Environmental Science: Processes and Impacts. 15 (1), 78-92 (2013).
- Hansen, S. F., et al. Nanoproducts- what is actually available to European consumers?. Environmental Science: Nano. 3 (1), 169-180 (2016).
- Vance, M. E., et al. Nanotechnology in the real world: Redeveloping the nanomaterial consumer products inventory. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 1769-1780 (2015).
- Farre, M., Gajda-Schrantz, K., Kantiani, L., Barcelo, D. Ecotoxicity and analysis of nanomaterials in the aquatic environment. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (1), 81-95 (2009).
- Walters, C. R., Pool, E. J., Somerset, V. S. Ecotoxicity of silver nanomaterials in the aquatic environment: a review of literature and gaps in nano-toxicological research. Journal of Environmental Science and Health. Part A, Toxic/hazardous Substances & Environmental Engineering. 49 (13), 1588-1601 (2014).
- Levard, C., Hotze, E. M., Lowry, G. V., Brown, G. E. Environmental transformations of silver nanoparticles: impact on stability and toxicity. Environmental Science & Technology. 46 (13), 6900-6914 (2012).
- Massarsky, A., Trudeau, V. L., Moon, T. W. Predicting the environmental impact of nanosilver. Environmental Toxicology and Pharmacology. 38 (3), 861-873 (2014).
- Wang, H., et al. Toxicity, bioaccumulation, and biotransformation of silver nanoparticles in marine organisms. Environmental Science and Technology. 48 (23), 13711-13717 (2014).
- Buffet, P. E., et al. A marine mesocosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana. Science of the Total Environment. 470, 1151-1159 (2014).
- Chen, M. H. Baseline metal concentrations in sediments and fish, and the determination of bioindicators in the subtropical Chi-ku Lagoon, S W Taiwan. Marine Pollution Bulletin. 44 (7), 703-714 (2002).
- Li, W. T., et al. Investigation of silver (Ag) deposition in tissues from stranded cetaceans by autometallography (AMG). Environmental Pollution. , 534-545 (2018).
- Chen, M. H., et al. Tissue concentrations of four Taiwanese toothed cetaceans indicating the silver and cadmium pollution in the western Pacific Ocean. Marine Pollution Bulletin. 124 (2), 993-1000 (2017).
- Li, W. T., et al. Immunotoxicity of silver nanoparticles (AgNPs) on the leukocytes of common bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Scientific Reports. , (2018).
- Bornhorst, J. A., Hunt, J. W., Urry, F. M., McMillin, G. A. Comparison of sample preservation methods for clinical trace element analysis by inductively coupled plasma mass spectrometry. American Journal of Clinical Pathology. 123 (4), 578-583 (2005).
- Bonta, M., Torok, S., Hegedus, B., Dome, B., Limbeck, A. A comparison of sample preparation strategies for biological tissues and subsequent trace element analysis using LA-ICP-MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (7), 1805-1814 (2017).
- Bischoff, K., Lamm, C., Erb, H. N., Hillebrandt, J. R. The effects of formalin fixation and tissue embedding of bovine liver on copper, iron, and zinc analysis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (2), 220-224 (2008).
- Miller, D. L., Yu, I. J., Genter, M. B. Use of Autometallography in Studies of Nanosilver Distribution and Toxicity. International Journal of Toxicology. 35 (1), 47-51 (2016).
- Anderson, D. S., et al. Influence of particle size on persistence and clearance of aerosolized silver nanoparticles in the rat lung. Toxicological Sciences. 144 (2), 366-381 (2015).
- Kim, W. Y., Kim, J., Park, J. D., Ryu, H. Y., Yu, I. J. Histological study of gender differences in accumulation of silver nanoparticles in kidneys of Fischer 344 rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 72 (21-22), 1279-1284 (2009).
- Danscher, G. Applications of autometallography to heavy metal toxicology. Pharmacology Toxicology. 68 (6), 414-423 (1991).
- Deroulers, C., et al. Analyzing huge pathology images with open source software. Diagnostic Pathology. 8, 92 (2013).
- Shu, J., Dolman, G. E., Duan, J., Qiu, G., Ilyas, M. Statistical colour models: an automated digital image analysis method for quantification of histological biomarkers. BioMedical Engineering Online. 15, 46 (2016).
- Geraci, J. R., Lounsbury, V. J. Specimen and data collection. Marine mammals ashore: a field guide for strandings. , 167-230 (2005).
- Shih, C. -. C., Liu, L. -. L., Chen, M. -. H., Wang, W. -. H. . Investigation of heavy metal bioaccumulation in dolphins from the coastal waters off Taiwan. , (2001).
- Liang, C. S., et al. The relationship between the striatal dopamine transporter and novelty seeking and cognitive flexibility in opioid dependence. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 74, 36-42 (2017).
- Spiess, A. N., Neumeyer, N. An evaluation of R2 as an inadequate measure for nonlinear models in pharmacological and biochemical research: a Monte Carlo approach. BMC Pharmacology. 10, 6 (2010).
- Stoltenberg, M., Danscher, G. Histochemical differentiation of autometallographically traceable metals (Au, Ag, Hg, Bi, Zn): protocols for chemical removal of separate autometallographic metal clusters in Epon sections. Histochemical Journal. 32 (11), 645-652 (2000).
- Dimitriadis, V. K., Domouhtsidou, G. P., Raftopoulou, E. Localization of Hg and Pb in the palps, the digestive gland and the gills in Mytilus galloprovincialis (L.) using autometallography and X-ray microanalysis. Environmental Pollution. 125 (3), 345-353 (2003).
- Loumbourdis, N. S., Danscher, G. Autometallographic tracing of mercury in frog liver. Environmental Pollution. 129 (2), 299-304 (2004).
- Stoltenberg, M., Larsen, A., Kemp, K., Bloch, D., Weihe, P. Autometallographic tracing of mercury in pilot whale tissues in the Faroe Islands. International Journal of Circumpolar Health. 62 (2), 182-189 (2003).
