מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום

זרימת נוזל זה הסימן סביבתי חשוב השולט תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים כגון vasodilation הנוצרות על-ידי זרימת נוזל נוזל הטיה תלויי-כוח וסקולרית שיפוץ ופיתוח^{1,2, 3,4,5}. למרות המנגנון המולקולרי אחר התגובות זרימת נוזל הטיה כוח ביולוגי אינם מובנים במלואם, הוא האמין כי תקנה בתיווך זרימת נוזל של יון ערוץ gating עשוי לתרום באופן ביקורתי תגובות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל^{5 , 6 , 7 , 8}. לדוגמה, הפעלת המתקן פנימה אנדותל Kir2.1 ו- Ca^{2 +}-activated K⁺ (K_Ca2.3, KCNN3) ערוצי לאחר Ca^{2 +} זרם על ידי זרימת נוזל כבר הציע לתרום נוזל זרימה-induced vasodilation^6,7,8. לכן, רבים תעלות יונים, ערוצי במיוחד מופעל מכנית או – עכבות, נחקרו מבחינת זרימת נוזל/הטיה רגישות כוח עם^{9,10 6,}טכניקה תיקון-קלאמפ ^{, 11}. עם זאת, בהתאם פרוטוקול נסיוני שבוצעה במהלך תיקון-קלאמפ הקלטה, תוצאות ופרשנות של הנתונים על זרימת נוזלים-תקנות של תעלות יונים יכול להיות מוטעים^10,11.

מקור אחד של חפצים הנוצרות על-ידי זרימת נוזל בהקלטה תיקון-קלאמפ היא מצומת פוטנציאלי בין נוזל אמבטיה Ag/AgCl הפניה אלקטרודה¹¹. בדרך כלל הוא האמין כי הצומת נוזלי/מטאל פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl אלקטרודה היא קבועה כמו ריכוז Cl^– של נוזל רחצה נשמרת יציבה, שוקל את התגובה הכימית בין הפתרון רחצה Ag/AgCl אלקטרודה להיות:

Ag + Cl^–↔ AgCl + אלקטרון (e^–) (משוואה 1)

עם זאת, במקרה שבו התגובה הכוללת אלקטרוכימי בין פתרון רחצה אלקטרודה הפניה Ag/AgCl (משוואה 1) ממשיך משמאל לימין, ריכוז Cl^– של נוזל רחצה צמוד Ag/AgCl הפניה אלקטרודה (שכבת גבול unstirred^12,13,14,15) עשוי להיות נמוך בהרבה מאשר בעיקר רחצה פתרון, אלא אם כן מספיק תחבורה convectional מובטחת. באמצעות אלקטרודה Ag/AgCl ישנים או לא אידאליות הכלרה לקוי של Ag עשוי להגביר סיכון כזה. החפץ הקשורות זרימת נוזל על האלקטרודה הפניה, למעשה, יכול להיות מהכלל על-ידי פשוט הנחת גשר מלח agarose המקובלת בין נוזל רחצה לבין התייחסות אלקטרודה, מאז החפץ מבוסס על שינויים אמיתיים Cl^– ריכוז הסמוך ה Ag/AgCl אלקטרודה¹¹. פרוטוקול שהוצגו במחקר זה מתאר כיצד למנוע את השינויים אפשריות הקשורות זרימת צומת ולמדוד את ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred.

לאחר הנחת agarose של אשלגן כלורי גשר בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, יש גורם מכריע נוסף שיש לשקול: Ag/AgCl אלקטרודה רק כהפניה מתנהג כמו אלקטרודה Cl^– , תעלות היונים גם יכול לתפקד כמו אלקטרודה יון סלקטיבי. המצב של שכבת הגבול unstirred בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה מתעוררת במהלך תנועת יונים בין הפתרונות חוץ-תאית, תאיים דרך תעלות היונים ממברנה. זה מרמז כי יש להשתמש בזהירות כאשר לפרש ברגולציה של יון ערוצי על ידי זרימת נוזלים. כפי שפורט המחקר הקודם שלנו¹¹, התנועה של יונים דרך פתרון שבו הדרגתי אלקטרוכימי קיים יכול להתרחש באמצעות שלושה ייחודי מנגנונים: דיפוזיה, הגירה, הסעת חום, איפה דיפוזיה התנועה המושרה על ידי ריכוז הדרגתי, ההעברה היא התנועה מונע על ידי מעבר חשמל צבע, הסעת חום הוא התנועה באמצעות זרימת נוזל. בין המנגנונים האלה תעבורה שלוש, הסעת חום מצב תורם לרוב את תנועת יונים¹¹ (> 1,000 פעמים גדול יותר מאשר דיפוזיה או ההעברה תחת הגדרות תיקון הרגיל-קלאמפ). זה מהווה את הבסיס התיאורטי של הסיבה צומת פוטנציאלי בין נוזל רחצה לבין Ag/AgCl הפניה אלקטרודה יכול מאוד תחת תנאים שונים סטטי ו זרימת נוזל¹¹.

לפי ההשערה המוצעת לעיל, כמה תופעות facilitatory של זרימת נוזלים בערוץ יון הנוכחי ניתן להסיק מן המחודשת הכנת ריכוז יון האמיתי סמוך לים ערוץ על פני הממברנה (שכבת גבול unstirred) ¹⁰. במקרה זה, ההשפעות הנוצרות על-ידי זרימת נוזל על יון ערוץ זרמי פשוט שהתעוררו מאירועים אלקטרוכימי, לא מן התקנון של gating ערוץ יון. רעיון דומה הוצע בעבר על ידי בארי ועמיתיו^12,13,14,15 בהתבסס על השיקולים התיאורטיים קפדני ועל ראיות, הידוע גם בשם השכבה unstirred או אפקט מספר תחבורה. אם כמה תעלות יונים יש מספיק מוליכות ערוץ אחד, מספיק זמן פתיחה-זמן לספק תחבורה מספקת שיעורי דרך הערוצים (מהירה יותר תחבורה תעריף של ממברנה מאשר על גבי המשטח ממברנה unstirred), אפקט בשכבת הגבול שעשויות להתעורר . לפיכך, התעבורה תלויי-הסעת חום יכול לתרום facilitations נוזל-זרימה-induced בסופו של דבר של יון הנוכחי^{10,12,13,14,15}.

במחקר זה, אנו שמים דגש על חשיבות באמצעות אגר או agarose מלח-גשר תוך כדי לימוד נוזל-זרימה-induced רגולציה של זרמי יונים. כמו כן, אנו מספקים שיטה למדידת ריכוז יון אמיתי בשכבת הגבול unstirred הסמוך Ag/AgCl הפניה אלקטרודה, הממברנה תעלות היונים. יתר על כן, הפרשנות תיאורטי של אפנון הנוצרות על-ידי זרימת נוזל הזרמים ערוץ יון (קרי, הסעת חום השערה או שכבה unstirred התחבורה מספר אפקט) יכולה לספק תובנות בעלות ערך עבור עיצוב ופרשנות מחקרים על הטיה הכוח-ברגולציה של תעלות יונים. על פי האפקט תעבורה בשכבת הגבול unstirred מספר, אנו צופים כי יון זרמי ערוץ דרך כל סוגי הממברנה תעלות יונים ניתן להקל על ידי זרימת נוזלים, באופן עצמאי את רגישותם ביולוגי לכוח הטיה זרימת נוזלים, אבל רק אם תעלות היונים יש מוליכות ערוץ אחד מספיק פתוח-זמן רב. צפיפויות הנוכחי של ערוץ יון גבוה יותר עשוי להגביר את האפקט unstirred בשכבת הגבול על פני קרום התא.