Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Strömung ist eine wichtige ökologische Cue, die vielen physiologische und pathologische Prozessen wie Fluid Flow-induzierte Vasodilatation und Flüssigkeit Scherkräfte Kraft-abhängige Gefäße Umgestaltung und Entwicklung^{1,2steuert, 3,4,5}. Obwohl die molekularen Mechanismen für die biologischen Reaktionen auf Flüssigkeitsströmung Querkraft nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass Fluid Flow-vermittelten Regulierung der Ionen-Kanal gating kritisch zur Fluid strömungsinduzierte Antworten⁵ beitragen können ^{, 6 , 7 , 8}. Z. B. Aktivierung von Endothelzellen nach innen Gleichrichter Kir2.1 und Ca^{2 +}-aktivierte K⁺ (K_Ca2,3, KCNN3) Kanäle nach Ca^{2 +} Zustrom von Flüssigkeitsströmung vorgeschlagen worden ist, beizutragen zur Flüssigkeit strömungsinduzierte Vasodilatation^6,7,8. Daher viele Ionenkanäle, vor allem mechanisch aktiviert oder -gehemmte Kanäle wurden untersucht im Hinblick auf die Kraftempfindlichkeit Fluid Flow/Scherung mit der Patch-Clamp Technik^{6,9,10 , 11}. abhängig vom experimentellen Protokoll während Patch-Clamp-Aufnahme durchgeführt, Ergebnisse und Interpretation der Daten auf Fluid Flow-Vorschriften von Ionenkanälen können jedoch fehlerhafte^10,11.

Eine Quelle der Flüssigkeit strömungsinduzierte Artefakte in der Patch-Clamp-Aufnahme ist aus der Kreuzung zwischen der Badflüssigkeit und Ag/AgCl Referenz-Elektrode¹¹möglichen. Es wird allgemein angenommen, dass die Flüssigmetall/Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl Elektroden konstant ist wie die Cl^– -Konzentration der Flüssigkeit Baden konstant gehalten, ist unter Berücksichtigung der chemischen Reaktion zwischen der Baden-Lösung und Ag/AgCl-Elektrode zu werden:

AG + Cl^–↔ AgCl + Elektron (e^–) (Gleichung 1)

Jedoch in einem Fall, wo die insgesamt elektrochemische Reaktion zwischen dem Baden Lösung und Ag/AgCl-Referenzelektrode (Gleichung 1) von links nach rechts verläuft, verweisen die Cl^– -Konzentration der Baden Flüssigkeit neben der Ag/AgCl Elektrode (ungerührte Grenzschicht^12,13,14,15) möglicherweise viel geringer als die in der Masse der Lösung, Baden, sofern genügend Konvektion Transport gewährleistet ist. Mit einer alten oder nicht-ideale Ag/AgCl-Elektrode mit unzureichenden Chlorierung der Ag kann dieses Risiko erhöhen. Dieses Fluid Flow-bezogene Artefakt an der Referenzelektrode, in der Tat kann ausgeschlossen werden, indem Sie einfach eine herkömmliche Agarose-Salz-Brücke zwischen Baden Fluid und Referenz Elektrode, da das Artefakt auf Veränderungen im realen Cl^– Angrenzend an die Ag/AgCl-Elektrode¹¹Konzentration. Das Protokoll in dieser Studie vorgestellt beschreibt die verhindern, dass die Junction Flow-im Zusammenhang mit möglichen Änderungen und echte Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht zu messen.

Nach dem Platzieren einer Agarose KCl-Brücke zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode, ist ein weiterer entscheidender Faktor, der berücksichtigt werden sollte: nur als Referenz Ag/AgCl-Elektrode wirkt wie ein Cl^– -Elektrode, die Ionenkanäle auch funktionieren können wie eine ionenselektive Elektrode. Die Situation der eine ungerührte Grenzschicht zwischen dem Baden Flüssigkeit und Ag/AgCl-Referenzelektrode entsteht während der Bewegung der Ionen zwischen den extrazellulären und intrazellulären Lösungen durch die Membran-Ionenkanäle. Dies impliziert, dass Vorsicht bei Auslegung der Verordnung von Ionen durch Flüssigkeitsströmung Kanäle verwendet werden soll. Wie in unserer vorherigen Studie¹¹besprochen, die Bewegung von Ionen durch eine Lösung, in denen eine elektrochemische Steigung vorliegt, kann auftreten, über drei verschiedene Mechanismen: Diffusion, Migration und Konvektion, wo Diffusion die Bewegung ist induziert durch Konzentrationsgradienten, Migration ist die Bewegung von elektrischen Gradienten angetrieben und Konvektion ist die Bewegung durch Fluid-Flow. Unter diesen drei Transportmechanismen trägt Konvektion-Modus die meisten um die Bewegung von Ionen¹¹ (> 1.000 Mal größer als Diffusion oder Migration unter üblichen Patch-Clamp-Einstellungen). Dies bildet die theoretische Basis warum Kreuzung Potenzial zwischen Baden Fluid und Ag/AgCl-Referenzelektrode sehr unter verschiedenen statischen und Fluid-Flow Bedingungen¹¹kann.

Gemäß der Hypothese oben vorgeschlagen, einige facilitatory Effekte der Strömung auf die aktuellen Ionenkanal können entnommen werden die konvektive Wiederherstellung der realen Ionenkonzentrationen angrenzend an die Kanal-Einlass an der Membranoberfläche (ungerührte Grenzschicht) ¹⁰. In diesem Fall die strömungsinduzierte Effekte von Flüssigkeiten auf Ionen-Kanal Strömungen entstanden einfach aus elektrochemischen Ereignisse nicht von der Regelung der Ionen-Kanal gating. Eine ähnliche Idee wurde zuvor von Barry und Kollegen^12,13,14,15 basierend auf strengen theoretischen Überlegungen und experimentelle Beweise, auch bekannt als die ungerührte Schicht vorgeschlagen oder Transport-Nummer-Effekt. Wenn einige Ionenkanäle genügend auftreten Einkanal-Leitfähigkeit und lange genug offene Zeit, ausreichend Transport Preise durch die Kanäle (Transport schneller in der Membran als in der ungerührte Membranoberfläche), einen Grenzschicht-Effekt zur Verfügung zu . So kann die Konvektion-abhängige Transport zum eventuellen Flüssigkeit-strömungsinduzierte Erleichterungen von Ionen-aktuelle^{10,12,13,14,15}beitragen.

In dieser Studie betonen wir, wie wichtig es ist, mit einem Agar oder Agarose Salz-Brücke während des Studiums Flüssigkeit-strömungsinduzierte Verordnung von Ionen strömen. Wir bieten auch eine Methode zur Messung der realen Ionenkonzentrationen in der ungerührte Grenzschicht angrenzend an die Ag/AgCl Referenz-Elektrode und Membran Ionenkanäle. Darüber hinaus bieten die theoretische Interpretation der Flüssigkeit strömungsinduzierte Modulation der Ionen-Kanal Ströme (z. B. Konvektion Hypothese oder ungerührte Transport Nummer Ebeneneffekt) wertvolle Erkenntnisse für die Gestaltung und Interpretation von Studien auf die Scherung Kraftregelung von Ionenkanälen. Nach dem ungerührte Grenzschicht Transport Nummer Effekt sagen wir voraus, dass Ionen-Kanal Ströme durch alle Arten von Ionenkanälen Membran durch Flüssigkeitsströmung, unabhängig von ihrer biologischen Empfindlichkeit gegenüber Flüssigkeitsströmung Querkraft, aber nur wenn gefördert werden kann die Ionenkanäle haben ausreichende Einkanal-Leitfähigkeit und lange offene Zeit. Höheren Stromdichten der Ionen-Kanal kann die ungerührte Grenzschicht Wirkung an der Oberfläche der Zellmembran erhöhen.