قياس تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك التصحيح مفتوحة: تدفق الآثار في السيطرة على قنوات أيون بالسوائل
Summary
غالباً ما تتم دراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع تسجيل التصحيح-المشبك. مع ذلك، يمكن النتائج المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون تبعاً للبروتوكول التجريبي، والخاطئة. هنا، نحن نقدم طرق لمنع وتصحيح مثل هذه الأخطاء مع أساس نظري.
Abstract
تدفق السائل هو حافز بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية إلى قوة تدفق السائل/الإمالة ليست مفهومة تماما، قد تساهم السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة خطيرة. ولذلك، درست حساسية قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون استخدام تقنية المشبك التصحيح. ومع ذلك، اعتماداً على البروتوكول التجريبي، والنتائج وتفسير البيانات يمكن الخاطئة. وهنا نقدم الأدلة التجريبية والنظرية للأخطاء المتعلقة بتدفق السوائل، وتوفير أساليب لتقدير ومنع وتصحيح هذه الأخطاء. التغييرات في مفرق المحتملة بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام قيست مع ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل. يمكن تدفق السائل ثم تحول mV تقاطع السائل/المعادن المحتملة إلى حوالي 7. على العكس من ذلك، عن طريق قياس الجهد التحول الناجم عن تدفق السوائل، قمنا بتقدير تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيريد. في حالة ثابتة، يمكن أن تصل إلى تركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي أو أيون قناة المدخل على سطح غشاء الخلية منخفضة حوالي 30% من أن في حالة تدفق. وضع [اغروس] 3 م بوكل جسر بين مسرى السائل ومرجع الاستحمام قد حالت هذه المشكلة من مفرق التحول المحتملة. ومع ذلك، يمكن أن لا ثابتة تأثير الطبقة أونستيريد متجاورة على سطح غشاء الخلية بهذه الطريقة. هنا، نحن نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة، مؤكدا على أهمية استخدام ملح على [اغروس]-جسر أثناء دراسة تنظيم السوائل الناجم عن تدفق التيارات أيون. ولذلك، هذا النهج المبتكر، الذي يأخذ في الاعتبار الحقيقي تركيزات الأيونات في طبقة الحدود أونستيريد، قد توفر نظرة مفيدة على التصميم التجريبي وتفسير البيانات المتصلة بتنظيم السوائل القص إجهاد قنوات أيون .
Introduction
تدفق السائل هو جديلة بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية والقص السائل تعتمد على قوة الأوعية الدموية يعيد البناء والتنمية1،2، 3،،من45. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل ليست مفهومة تماما، هو يعتقد أن السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة قد تسهم حاسمة في الاستجابات الناجمة عن تدفق السوائل5 , 6 , 7 , 8. على سبيل المثال، تنشيط مقوم إلى الداخل بطانية Kir2.1 و Ca2 +-تنشيط ك+ (2.3 كالمرجع المصدق، KCNN3) القنوات بعد قد اقترح Ca2 + تدفق بتدفق السوائل للمساهمة في السوائل توسع الأوعية الناجمة عن تدفق6،،من78. لذلك، العديد من القنوات الأيونية، قنوات خاصة تنشيط ميكانيكيا أو-تحول دون، وقد درست من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع التصحيح-المشبك تقنية6،،من910 , 11-ومع ذلك، تبعاً للبروتوكول التجريبية التي يتم إجراؤها أثناء تسجيل التصحيح المشبك، النتائج وتفسير البيانات المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون يمكن أن تكون الخاطئة10،11.
مصدر واحد من التحف التي يسببها تدفق السائل في تسجيل التصحيح-المشبك من مفترق الطرق المحتملة بين السوائل حمام و القطب مرجع Ag/AgCl11. ويعتقد عموما أن تقاطع السائل/المعادن المحتملة بين سائل الاستحمام والقطب Ag/AgCl ثابت كما أن تركيز Cl– من سائل الاستحمام تظل ثابتة، النظر في الاستجابة الكيميائية بين الحل الاستحمام وقطب Ag/AgCl لتكون:
Ag + Cl–↔ AgCl + إلكترون (e–) (المعادلة 1)
ومع ذلك، في حالة حيث رد فعل الكهروكيميائية عموما بين حل الاستحمام والقطب مرجع Ag/AgCl (المعادلة 1) ينطلق من اليسار إلى اليمين، تركيز Cl– من سائل الاستحمام المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي (طبقة الحدود أونستيريد12،13،،من1415) قد تكون أقل بكثير من ذلك في الجزء الأكبر من الاستحمام الحل، ما لم تضمن ما يكفي النقل كونفيكشونال. استخدام قطب Ag/AgCl القديمة أو غير المثالية مع عدم كفاية كلورة Ag قد يزيد هذا خطر. ويمكن استبعاد هذه الأداة المتعلقة بتدفق السوائل في مسرى الإشارة، في الواقع، بمجرد وضع جسر [اغروس]-الملح تقليدية بين سائل الاستحمام ومرجع القطب، قطعة أثرية مبنية على التعديلات في Cl الحقيقي– تركيز المتاخمة ل القطب Ag/AgCl11. البروتوكول الواردة في هذه الدراسة، توضح هذه المقالة كيفية منع التغييرات المحتملة المتصلة بتدفق مفرق وقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد.
بعد وضع [اغروس] بوكل جسر بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl، هناك عامل حاسم آخر ينبغي النظر فيه: قطب Ag/AgCl فقط كالمرجع أعمال مثل قطب Cl– ، قنوات أيون أيضا يمكن أن تعمل مثل قطب الأيوني انتقائي. تنشأ حالة طبقة الحدود أونستيريد بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl أثناء حركة الأيونات بين الحلول خارج الخلية وداخل الخلية عن طريق قنوات أيون الغشاء. وهذا يعني أنه ينبغي توخي الحذر عند تفسير اللائحة لايون القنوات بتدفق السائل. كما نوقش في أعمالنا السابقة دراسة11، حركة الأيونات من خلال حل موجود تدرج الكهروكيميائية التي يمكن أن تحدث عن طريق ثلاث آليات متميزة: نشر، والهجرة، والحمل الحراري، حيث يتم نشر الحركة الناجمة عن الانحدار تركيز، الهجرة هي حركة يقودها التدرج الكهربائية، والحمل الحراري هو الحركة من خلال تدفق السائل. بين هذه الآليات النقل الثلاثة، يساهم الوضع الحراري معظمها إلى حركة أيونات11 (000 1 > مرة أكبر من نشرها أو الهجرة ضمن إعدادات التصحيح-المشبك المعتاد). وهذا يشكل الأساس النظري للسبب في مفرق المحتملة بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl يمكن جداً تحت ظروف ثابتة وتدفق السوائل المختلفة11.
حسب الفرضية المقترحة أعلاه، يمكن الاستدلال بعض الآثار مسهل لتدفق السوائل على قناة أيون الحالية من إعادة الحمل الحراري بتركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لمدخل القناة على سطح غشاء (طبقة الحدود أونستيريد) 10. في هذه الحالة، الآثار الناجمة عن تدفق السائل على أيون قناة التيارات نشأت من أحداث الكهروكيميائية، ليس من تنظيم أيون قناة النابضة ببساطة. واقترح باري والزملاء12،13،،من1415 استناداً إلى اعتبارات نظرية صارمة والأدلة التجريبية، والمعروف أيضا طبقة أونستيريد سابقا فكرة مماثلة أو تأثير عدد النقل. إذا كان بعض القنوات أيون كافية قد تنشأ الموصلية قناة واحدة وطويلة بما يكفي فتح الوقت لتوفير معدلات النقل كافية من خلال القنوات (أسرع معدل نقل في الغشاء من سطح غشاء أونستيريد،) تأثير طبقة الحدود . وهكذا، يمكن أن يسهم النقل الحراري-تعتمد على التسهيلات التي يسببها تدفق السائل في نهاية المطاف لايون الحالية10،،من1213،،من1415.
في هذه الدراسة، ونشدد على أهمية استخدام أجار أو [اغروس] الملح-جسر أثناء دراسة تنظيم التيارات أيون الناجم عن تدفق السائل. كما نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في أونستيريد الطبقة الحدودية المتاخمة لقنوات أيون Ag/AgCl القطب والغشاء مرجع. وعلاوة على ذلك، تفسير نظري للتحوير السوائل الناجم عن تدفق التيارات قناة أيون (أي فرضية الحراري أو تأثير طبقة أونستيريد النقل رقم) يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تصميم وتفسير الدراسات في القص القوة-تنظيم قنوات أيون. وفقا لتأثير طبقة الحدود أونستيريد رقم النقل، ونتوقع أن أيون قناة التيارات من خلال جميع أنواع غشاء أيون قنوات يمكن أن تيسره تدفق السوائل، مستقلة عن الحساسية البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل، ولكن فقط إذا قنوات أيون لها كافية قناة واحدة الموصلية وفتح-منذ وقت طويل. قد تزيد من أعلى الكثافات الحالية قناة أيون تأثير طبقة الحدود أونستيريد على سطح غشاء الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي هذه الدراسة، أثبتنا طريقة لقياس تركيز Cl– الحقيقية في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب مرجع Ag/AgCl بتحديد تقاطع السائل المعدنية المحتملة مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة مليئة بوكل عالية التركيز. يمكن أن يؤدي التغيير في تركيز Cl– في طبقة الحدود تحولاً إمكانات تقاطع عند التبديل من ثا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان يدعمها “العلم بحوث البرامج الأساسية” (2015R1C1A1A02036887 وجبهة الخلاص الوطني-2016R1A2B4014795) من خلال “مؤسسة البحوث الوطنية كوريا” تموله وزارة العلوم، تكنولوجيا المعلومات والاتصالات “برنامج مركز بحوث رائدة” (2011-0027921)، “تخطيط المستقبل”، ومنحة من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال معهد التنمية الصناعة (خيدي) كوريا الصحة، تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (HI15C1540).
Materials
| RC-11 open bath chamber | Warner instruments, USA | W4 64-0307 | |
| Ag/AgCl electrode pellet | World Precision Instruments, USA | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich, USA | A9793 | |
| Voltage-clamp amplifier | HEKA, Germany | EPC8 | |
| Voltage-clamp amplifier | Molecular Devices, USA | Axopatch 200B | |
| Liquid pump | KNF Flodos, Switzerland | FEM08 |
References
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585 (2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- . A procedure for the formation of agar salt bridges Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018)
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
