JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

Published: November 01, 2018
doi:
10.3791/58224
, , , , , ,
1Institute of Medical Biochemistry, Center for Molecular Biology of Inflammation,University of Münster, 2Institute of Biochemistry,University of Münster, 3Cluster of Excellence ‘Cells in Motion’,University of Münster

Summary

Burada, bağlama benzeşim ve aynı anda ölçerek immobilize katı destekli bilayers ile (SLB) A2 annexin etiket içermeyen fosfolipid bağlayıcı protein etkileşim modunu belirlemek için istihdam deneysel bir iletişim kuralı mevcut kütle alımı ve A2 annexin protein visko elastik özellikleri.

Abstract

Aynı anda etkileşim ölçümleri sağlayan sensör yüzeylerde absorbe/immobilize kitle kütle alımı ve visko elastik özelliklerini ölçmek için basit ve etiket içermeyen bir yaklaşım dissipative kuvars kristal microbalance tekniktir proteinlerin yüksek bir hassasiyet ile gerçek zamanlı olarak lipid bilayers gibi katı destekli yüzeyler ile. Annexins geri dönülebilir olarak kalsiyum iyonları koordinasyonu olumsuz ücret headgroups yolu ile ile etkileşim fosfolipid bağlanıcı proteinler son derece korunmuş bir grubuz. Burada, kantitatif analiz A2 annexin bağlama için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak (AnxA2) bir kuvars sensör yüzeyinde hazırlanan düzlemsel lipid bilayers için. Bu iletişim kuralı sağlam ve tekrarlanabilir verileri elde etmek için en iyi duruma getirilmiş ve ayrıntılı adım adım açıklamasını içerir. Yöntem diğer membran bağlanıcı proteinler ve bilayer besteleri için uygulanabilir.

Introduction

Hücresel zarları son derece dinamik ve karmaşık yapılardır. Membran lipidler, periferik ve/veya bütünsel bir şekilde ilişkili membran proteinlerinin, birlikte bileşik karışımı formu microdomains için topla. Bu membran microdomains koordineli tempo mekansal organizasyonu temel fizyolojik süreçleri1‘ de yer almaktadır. Membran microdomain dynamics membran lipidler etkileşimi yanı sıra çevresel membran proteinlerinin tanımak ve microdomains zenginleştirilmiş lipidler ile etkileşim yeteneği tarafından tahrik edilmektedir. Belirli lipidler protein alımı genellikle elde ile lipid-tanıma modülleri, pleckstrin Homoloji (PH) veya C2 etki alanları2,3gibi olur. Biyofiziksel analitik yöntemleri modeli membranlar kullanarak bu işlemleri moleküler seviyede yöneten temel ilkeleri anlama anahtarıdır.

Annexins, büyük bir multigene Aile, olumsuz ücret membran lipidler, ağırlıklı olarak Fosfatidilserin (PS), bir Ca2 +içinde bağlamak yeteneklerini için iyi bilinen-kontrollü bir şekilde2. Korunmuş bir yapısal kesimi varlığı annexin ailesinin ikinci özelliğidir annexin tekrar, yani mevcut dört ya da sekiz kez ve Ca2 +– ve fosfolipid bağlayıcı siteleri4limanlar. Ca2 +-bağımlı lipid etkileşim yerler annexins duygusu ve Ca2 +iletmek için mükemmel bir konumda-hedef membranlar için sinyal aracılı. Sürekli olarak, annexins kolesterol, phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P2) ve PS, hem hücresel ve/veya yapay membran sistemleri5zenginleştirilmiş microdomains oluşumu teşvik edebiliyoruz. Bu iletişim kuralı bir kuvars kristali Microbalance dağılımı (QCM-D)6,7,8kullanarak annexin-membran etkileşim çözümlenecek bir yaklaşım açıklar.

Bu microbalance temel sensör yüzeyi olarak hizmet veren bir salınım kristal bileşenidir. Adsorpsiyon ve/veya bağlama sensör yüzeye moleküllerin azalır rezonans frekansı (f) kitle artış doğru orantılı. Eşit bir film ile kaplı yüzey ek maddeler bağlama bu katman yapısal bütünlüğü ile girişime neden olabilir ve bu tür değişimler alakalıdır (enerji dağıtımı faktörü D) Ayrıca izlenebilir. Bu proteinler arasındaki etkileşimin lipid bilayers ile çalışmak için yaygın bir tekniktir. Bu yaklaşım, lipid veziküller uygun şekilde kaplanmış algılayıcı yüzeyine emilir. Lipid bilayer oluşumdur silis esaslı malzemeler9,10, olumlu veziküller genellikle diğer hidrofilik yüzeylerde rüptürü değil gibi UV-ozon pozlama, TiO212veya Al sonra altın11 okside gibi 2O313. Coalescing veziküller rüptürü kitle ve sefahat karakteristik değişiklikler için önde gelen sulu faz serbest bırakır. Katı destekli bilayers (SLB) vezikül Fusion nesil basit ve sağlam ve hücresel zarları taklit karmaşık modeller oluşturmak için kullanılabilir.

Dissipative kuvars kristal microbalance etiket içermeyen ve hassas bir tekniktir. Önemli bir avantajı böylece çok çeşitli farklı araştırma alanlarda uygulamaları sağlayan yüzeyine yeteri kadar ince bir film oluşturur herhangi bir malzeme kat için imkanı vardır. Protein-membran etkileşim içinde gözlenen gerçek zamanlı, ve sonuçları doğrudan çözümlenebilir. (En az bir temizlik bu protokol için açıklandığı gibi yaptıktan sonra), sonraki ölçümlerde aynı sensör yüzeyi kullanılabilir böylece doğru iç kontrol ve karşılaştırılabilir arasında analitler için izin.

Protocol

Not: Arabellekleri 0,22-µm filtre kullanarak ve 1 h için bir vakum tarafından degassed filtre. 1. lipid vezikül hazırlık 2-mL Cam tüpler kullanın. Her lipid çözülür 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (pop) ve kolesterol (CHOI), kloroform bir karışımı / bir açık 5 mM lipid çözüm hazırlamak için metanol (50: 50 v/v). 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-Myo-İnositol-4′,5′-bisphosphate) (PI (4,5) P2) kloroform/metanol/su (20:9:1 v/v) bir karışımı olarak geçiyoruz. POPC/çıkar (80/20), POPC/PI (4,5) P2 istenen molar oranını içinde çözünmüş lipidler birleştirmek (95/5), POPC/çıkar/Choi (60/20/20), POPC/çıkar/PI (4,5) P2/Chol (60/17/3/20) ve POPC/DOPC/çıkar/PI (4,5) P2/Chol (37/20/20/3/20) () Tablo 1) 10 mL Cam tüplerde.Not: Son toplam lipid 500 µg miktarıdır. Azot Kuru bir akışı kullanarak organik çözücüler buharlaşır. Çözücüler herhangi bir kalıntı izleri kaldırmak 3 h için bir yüksek vakum (lyophilization) sistemde lipid karışımı bırak.Not: Bu bir kuru net film olur. Lipit filmin 1 mL sitrat arabellek (TRISODYUM 10 mM-sitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6) resuspend. Lipid süspansiyon (Bu sıcaklık ise en yüksek erime lipid karışımı faz geçiş sıcaklığı yaklaşık 10 ° C) 60 ° C’de 30 dk içinde bir su banyosu ve girdap için kuluçkaya bu şiddetle her 5 dak.Not: Bu büyük, multilamellar veziküller (MLVs) oluşumuna neden olur. Süspansiyon geçiş sıcaklığı tutmak. Donatmak için 30 dk 50 nm çapında gözenek boyutu Polikarbonat membran (olan 40-50 ° C burada) geçiş sıcaklığı yukarıda ile Ekstruder (60 ° C’de bu durumda) Onceden. MLV süspansiyon ısıtılmış ekstruder yük ve hafifçe karışım 31 x Küçük unilamellar veziküller (SUV)14oluşturmak için Polikarbonat membran aracılığıyla geçmek. Sıcaklık geçiş sıcaklığı yukarıda tut. SUV süspansiyon 2 mL plastik tepki gemi nakletmek ve sitrat arabellek eklemek (bkz. Adım 1.4) son Hacim 2 mL getirmek için.Not: Bu bir son lipid konsantrasyon 250 µg/mL ortaya çıkarır. 2. işleme kuvars sensörler Not: Her zaman kuvars sensörleri bir cımbız ile başa. Dört kuluçkaya sensörler eklenmiş bir Politetrafloroetilen tutucu ≥ 30 dk. Yıkama için % 2 SDS çözümünde onları kapsamlı ultra saf su ile tamamen SDS kaldırmak ve onları kuru argon veya azot akışı kullanarak kuru. Plazma temizleme sistemi tamamen herhangi bir kirletici kaldırmak için kullanın. Kuru sensörler plazma temizlik odasında yerleştirin, tahliye odası ve sifonu oksijen ile 3 x. Plazma temizleyici olarak açın. Aşağıdaki işlem parametreleri kullanın: 1 x 10-4 Torr basınç, yüksek radyo frekansı (RF) güç ve işlem süresi 10 dak. Makineyi ve sensörler almak. 3. microbalance operasyon Not: Dört ısı kontrollü akış chambers peristaltik pompa için bağlı ve 80 µL/dk, debi için ayarla paralel bir yapılandırmada, bir microbalance sistemiyle kullanıldı. Açık akış modunda arabellek besleyici rezervuar alıcı tankına pompalanır oldu. Döngü modunda alıcı tank kapalı bir döngü oluşturmak için besleyici rezervuar ile bağlantılıydı. Sıcaklık 20 ° C’ye kuruldu Dikkatle plazma temizlenmiş sensörler Cımbız kullanarak 4 akış Chambers’ı yerleştirin. Herhangi bir baskı ya da burulma odalar ve sızıntı neden olabilir tüpler kaçının. Sitrat arabelleği (TRISODYUM 10 mM-sitrat, 150 mM NaCl, pH 4.6) açık akış modu 10 dakika ile sistem floş.Not: Bu tam olarak 3,2 mL arabelleği gerektiriyor ancak arabellek (10 mL) aşırı kullanılması önerilir. Programı başlatın. Herhangi bir değişiklik sıklığı ve dağılımı ilk temel sesi kaydetmeye başlamak (n = 1) ve overtones (n 3-13 =) sıklığı ve dağılımı taban stabil olana yazılımıyla (Bu yaklaşık 40-60 dakika sürer).Not: Frekans ses seviyesi (tepe-tepe) 0.5 Hz daha ve dağılımı, 0.1·10 düşük için düşük olmalıdır-6, 1 Hz/h frekans ve 0.3·10 (içinde sulu çözüm) maksimal bir sürüklenme ile-6/h sefahat içinde. Taban çizgilerine stabildir SUV süspansiyon sitrat arabelleği (küçük bir tüp 2 mL) uygulanır. Bir reaksiyon gemi kullanarak, ölü hacminin 1.5 mL kaldırın. Sonra döngü akış modda sistemi kapatın. Kayıt frekans/dağılımı kayması için 10 dakika daha.Not: Bu süre boyunca, veziküller SiO2 yüzeye yayılmış ve bir sürekli bilayer15,16 (adım 2 rakamlar 1, resim 2ve Şekil 3′ de) oluşturmak için sigorta. Sensör yüzeyinde SUV’lar adsorpsiyon iki phasic ve minimum ve maksimum sefahat içinde tipik bir frekansı vardır. 26-29 Hz (bağlı olarak lipid kompozisyon) bir karakteristik frekans kayması ile istikrarlı bir yeni frekans/dağılımı taban çizgisi (bkz. Tablo 1) sürekli bilayer yüzeyi gösterir. SLB ne zaman istikrarlı (bkz. Adım 3.4), sistem konsantrasyonlarda (50 µM kadar 1 mM CaCl2, deneme bağlı olarak değişen) gerekli Ca2 + için bir açık akış modunda çalışan arabelleği (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) ile equilibrate 40 dak. Protein ekleyin (burada, AnxA2) için çalışan içeren Ca2 + tampon (bkz. Adım 3.5). (Adım 3 resim 1, resim 2ve Şekil 3) bir denge kararlı duruma ulaşıncaya kadar protein uygulama bir döngü akış modunda gerçekleştirin.Not: Protein konsantrasyonu 1 ile 400 arasında nM. Protein adsorpsiyon kitle (protein) adsorpsiyon yansıtan bir konsantrasyon bağımlı frekans kayma sonuçları. İlişkili protein Ca2 + iyonları ile 5 mM EGTA (adım 4 rakamlar 1 ve Şekil 2) açık akış modunda çalışan arabellekte şelat tarafından ayırmak.Not: Bir kurtarma sıklığı ve dağılımı SLB temel protein bağlayıcı bir toplam reversibility gösterir. Derneği-ayrılma döngüleri farklı konsantrasyonları veya proteinler karşılaştırmak için tekrar edilebilir. 4. microbalance temizlik Not: her ölçüm sonra en az bir temizlik yordamı gerçekleştirin. 50 mL microbalance sistemiyle GKD2O sürekli açık akış modunda yeniden, tüpler su kapsayıcıdan kaldır ve Kuru çalıştırın sistem izin. Dikkatli bir şekilde kristal sensör çıkarın ve % 2 SDS Çözüm Politetrafloroetilen tutucu kullanarak temizleyin (bkz. Adım 2.1). Sensör yerleştirildiği akışı modülü iç görünür bölümlerini kuru.Not: yoğun bir yordam 10 ölçümler bir dizi sonra temizleme gerçekleştirmek. Temiz belgili tanımlık sistem % 2 SDS Çözüm (50 mL) ile 40 ° c (kurulum yazılımı) deterjan ile genişletilmiş temas için bir akış hızı 20 µL/dk kullanılarak bir sürekli açık akış (tüp) modunda. GKD2O 160 µL/dk akış hızında sürekli açık akış modunda 250 mL ile temizleyin.Not: 4 ay sonra kapsamlı bir temizlik yordamı Üretici kılavuzuna göre yerine getirir.

Representative Results

Rezonans frekansı (Δf) azalma Sauerbrey denklemi tarafından tanımlandığı gibi adsorbed kitle (Δm), doğrusal bir şekilde ilişkili olan. 17 Burada, f rezonans frekansı, Cf verilen kuvars ve rezonans frekansı geometrik ve fiziksel özellikleri üzerinde bağlıdır bir sabit ve A sensör yüzey alanıdır. Çoğu uygulamada adsorbed katman viskoelastik tamamen katı değil. Elde edilen kuvars sensör salınım nemlendirme dağılımı (D) adlandırılır. Değişiklikler (ΔD) ilişkili kitle18 visko elastik özellikleri ile ilişkilendirmek ve çoğu izlenen dağılımı aşağıdaki gibi8tanımlı. Burada, Eharcanmış bir salınım dönemi boyunca kayıp enerji ise Edepolanan toplam enerji serbestçe salınan sensör. Çözümlemek ve bağlama parametrelerine ölçmek için frekans isotherms protein konsantrasyonları karşı denge frekans vardiya (ΔΔfe) komplo tarafından elde edilmiştir. ΔΔfe olarak tanımlanmıştır. Burada, Δft1 protein adsorpsiyon ve Δft2 denge duruma başlangıcını temsil eder. Doğrusal olmayan eğri uydurma Hill genişleme6,8aşağıdaki gibi Langmuir denklem kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, ΔΔfMaksimum (doyurarak) maksimum bağlamasında kaynaklanan protein konsantrasyonu ΔΔfe , Kd protein/membran karmaşık görünen ayrışma sabittir, ve n Hill katsayısıdır. Hill katsayısı (n) bağlama cooperativity açıklar. N = 1, (eşit bağlayıcı siteleri ve tüm molekülleri bağlamak birbirinden bağımsız olarak lipid bilayer) basit bir Langmuir İzoterm Hill adsorpsiyon modelidir. N ≠ 1, ilişkili bir ligand diğer ligandlar benzeşim bağlama membran değişirse, ya (n > 1, olumlu cooperativity) artan veya azalan (n < 1, negatif cooperativity) benzeşimi. Şekil 1 gösterir bizim laboratuvar olarak vardiya rezonans ve frekans Ca2 +sırasında ölçmek için kullanılan deneysel iş akışının bir şematik-bağımlı bağlama ve lipid bilayer sıvı faz AnxA2 sürümüne. Örnek bir kaydı Şekil 2′ de gösterilmiştir. Resim 2 A frekans eğrisi kaydını gösterir ve Şekil 2B dağılımı vardiya gösterir. Frekans lipozomlar (Şekil 2A [adım 1]) eklenmesi üzerine önemli düşüş onların adsorpsiyon gösterir. Çünkü arabelleği dolu veziküller katı değildir ama viskoelastik, dağılımı (Şekil 2B [adım 1]) artırır. Daha sonra coalescing veziküller yırtılması. İstikrarlı bir plato (Şekil 2A [adım 2]) ulaşılana kadar eşlik eden yayın arabelleği veziküller içinde adsorbed kitle azaltır. Bilayer yanıt vardiyada SLB (Şekil 2B [adım 2]) katı homojen yapısı nedeniyle çok daha küçük olmakla birlikte belirtmek gerekirse yüksek dağılımı vardiyada veziküller eklenmesiyle sonuçlanır. Şekil 2A ve 2B’yi kayıtlarında AnxA2 bağlama tarafından açık frekans kayması görüldüğü gibi kitle, ekler, ancak bilayer yapısı ile müdahale değil, lipitler için sadece küçük bir değişiklik sefahat içinde gösterildiği gibi adım 3. CA2 + bağlayıcı ajan EGTA (resim 1 ve Şekil 2 [adım 4]) tarafından kaldırıldığında, AnxA2 lipid filmden ayrışıp. Frekans yanı sıra dağılımı kayıtları ile bilayer sadece (karşılaştırma adım 2 ve 4 Şekil 2A ve 2B), AnxA2 bağlama CA’yı tamamen bağımlı olduğunu belirten gördüm düzeyleri kaymak2 + ve lipit filmin değişmeden kalır. Gibi en AnxA2, annexins PS gibi olumsuz ücret lipidler bağlıdır Bu pop’ları yok ne zaman açıkça görülüyor, lipid bilayer (Şekil 3). Şekil 3 A frekans eğrisi kaydını gösterir ve Şekil 3B dağılımı vardiya gösterir. Frekans-25 Hz’de istikrarlı bir temel geçirir, henüz dağılımı değil Not uygun bilayer oluşumu (Şekil 3B [adım 2]), gösterge değişmiş. Ancak, herhangi bir değişiklik frekans (Şekil 3A) veya dağılımı (Şekil 3B) AnxA2 ilavesi huzurunda Ca2 + (Şekil 3A ve 3B [adım 3]) veya EGTA (Şekil sonra gözlenir 3A ve 3B [adım 4]), AnxA2 lipid film ile etkileşimli işlemler yapamazsınız. Resim 1 : Deneysel iş akışının grafik modeli. Bu iş akışı vezikül emme hidrofilik sensör yüzeye (adım 1), vezikül füzyon/kopma SLB oluşumu (adım 2) ve Ca2 +yol gösterir-bağımlı adsorpsiyon (adım 3) ve AnxA2 EGTA bağımlı desorpsiyon (adım 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Resim 2 : Örnek kayıt. Bu paneller zamana bağımlı 7 armonik ses rezonans frekansını izleme(a)göstermek ve (B) dağılımı, kuvars detektörler ölçüm sırasında geçer. (Adım 1) dağılımı temel artırır, ancak lipozomlar uygulanması frekans temelde hızlı bir düşüş neden olur. Taban çizgilerine istikrar bilayer (adım 2) oluşumu gösterir. AnxA2 (200 nM) pop’ları içeren lipid bilayer üzerine (huzurunda Ca2 +) adsorpsiyon önemli ölçüde dağılımı, (adım 3) lipit filmin değil tedirgin gösteren değiştirmeden toplu ekler. Ca2 + şelasyon EGTA ile üzerine frekans temellerin kurtarma toplam desorpsiyon protein (adım 4) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Negatif kontrol deney, gösteren AnxA2 çıkar, yokluğunda SLBs için bağlanmaz. Bu paneller lipozomlar ve SLB oluşumu (adım 1 ve 2) eklenmesi göstermektedir. Herhangi bir değişiklik(a)frekans veya (B) dağılımı AnxA2 eklenmesinden sonra belirgin (adım huzurunda Ca2 +3; 200 nM) veya EGTA (adım 4). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.  Kompozisyon ΔΔF/Hz SLBs oluşumu sonra ΔΔD * 10-6 sonra SLB oluşumu POPC/ÇIKAR(80: 20) 26.3 ± 0.2 0,26 ± 0.03 POPC/PI (4,5) P2(95: 5) 26.5 ± 0.5 0.31 ± 0,02 POPC/çıkar/Choi(60: 20: 20) 29.2 ± 0.2 0,45 ± 0,09 POPC/çıkar / (4,5) P2/Chol PI(60: 17: 3:20) 29.6 ± 0,6 0.43 ± 0.10 POPC/DOPC/çıkar / (4,5) P2/Chol PI(37: 20: 20: 3:20) 29,4 ± 0,4 0,39 ± 0,14 Tablo 1: Lipid bileşimi ve oluşumu veri SLB, 7 .

Discussion

Nicel ve nitel bir şekilde hücre membran yapısı-işlev ilişki ile ilgili soruları cevaplamak için hücre biyolojisi karlarından son derece biyofiziksel yaklaşımlar kullanımı dayalı köklü ve yaygın olarak kullanılan teknikleri , dahil atomik kuvvet mikroskobu (AFM), yüzey plasmon rezonans (SPR), ve QCM-D tekniği istihdam burada. Annexin protein bir Ca2 +içinde bağlama önceki çalışmalarda gösterdi-yüksek benzeşimli immobilize membran için bağımlı bir şekilde. Frekansı kullanan ve bu en iyi uzlaşma ile algılama hassasiyeti ve salınım istikrarı temsil ettiği 7 armonik ses (Δf7) sefahat kaydırır.

Bu teknik de membran protein etkileşim nicel bir açıklamasını verir. AnxA2 bağlama membran için korunmuş annexin çekirdek etki alanı tarafından aracılık ettiği ve kolesterol varlığını bağlıdır olumlu cooperativity karakterizedir. AnxA2 ve AnxA8 içinde bildirilen elde edilen nicel veriler başka bir yerde6,8ayrıntı.

Bu protokol için birçok kritik adımlar vardır. Lipozomlar hemen kullanın; Aksi takdirde, Küçük veziküller ile daha az yüzey gerilimi, lipid bilayer oluşumu inhibisyonu için önde gelen büyük veziküller içine sigorta. Sabit bir sıcaklık ölçümleri sırasında korumak. Sıcaklık her küçük sapma değil ihmal edilebilir bir sıklığı ve dağılımı vardiyada sonuçlanır. Hava kabarcıkları kaçının; Aksi takdirde, sistem kararsız ve bir taban çizgisi oluşturun değil.

Sauerbrey denklem gözlenen frekans doğrudan dönüşüm değişikliklere kütlesi değişir ve olduğunu, bu nedenle, yaygın olarak kullanılan sağlar. Ancak, rezonans frekansı değişikliği ve eklenen kitle arasında doğrusal bir ilişki varsayımı sadece sert ve düzgün film sensör yüzeyinde oluşturan bileşenleri için geçerlidir. Sauerbrey denklem visko elastik adsorbents su bakımından zengin protein filmleri, lipid katmanlar dahil suyla gibi için kullanılamaz veya bile hücreleri adsorbe. Burada, daha karmaşık matematiksel modeller gereklidir. Bu nedenle, aynı anda sıklığı ve dağılımı değişiklikleri izlemek son derece önemlidir. Ölçüm sırasında yapısal değişiklikleri algılamak için ΔD karşı Δf oranları, konformasyon değişiklik gösteren düz bir çizgi ile çizilebilir.

Bu tekniğin büyük avantaj malzemeler çok çeşitli yüzeyler kullanma imkanı sağlıyor. Ayrıca, bu güvenilir ve doğrudan bir yöntem daha fazla protein-lipid etkileşimleri yanı sıra, makromoleküllerin etkileşimleri, geniş bir yüzey kaplama filmleri (örneğin SLB), uygun oluşumu olarak çalışmaya online izlenebilir.

Bu iletişim kuralı olabilir membran etkileşim diğer proteinler için örneğin, etki alanı proteinler19BAR, membran-sitoiskeleti bağlantı20‘,21 önemli bir role sahiptir ERM (ezrin, radixin ve moesin) protein ailesi geçerli. ,22veya C2 veya PH etki alanları içeren proteinler. Ayrıca, çok çeşitli uygulamalar bu tekniğin Biyolojik materyallerde çalışmaya başarıyla böylece QCM daha karmaşık makromoleküllerin derlemeler veya bile etkileşimler çalışmaya uygun bir deneysel platformu olarak kurulması yayınlanmış 23,24hücreleri.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 ve SFB 1348/A11 altında tarafından desteklenmiştir.

Materials

Chemicals
Calciumchloride Merck 017-013-00-2 99%
Chloroform Roth 4432.1 99%
DOPC Avanti 850375P
EGTA PanReac AppliChem A0878 99%
HEPES PanReac AppliChem A1069
Methanol PanReac AppliChem A3493
PiP2 Avanti  850155P
POPC Avanti  850457P
POPS Avanti  840034P
Sodiumchloride PanReac AppliChem A1149
SDS Roth 183
Trisodium citrate PanReac AppliChem A3901
Equipment 
Extruder Liposofast Avestin
Qsense E4 Analyzer Qsense
QSense Dfind Qsense
Pump IPC 4 Ismatec ISM 930
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm Qsense QSX 303
PC Membranes 0.05μm Avanti polar lipids 610003
OriginPro OriginLab Corporation Version 8 and 9
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).
  2. Gerke, V., Creutz, C. E., Moss, S. E. Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 449-461 (2005).
  3. Mim, C., Unger, V. M. Membrane curvature and its generation by BAR proteins. Trends in Biochemical Science. 37, 526-533 (2012).
  4. Rescher, U., Ruhe, D., Ludwig, C., Zobiack, N., Gerke, V. Annexin 2 is a phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate binding protein recruited to actin assembly sites at cellular membranes. Journal of Cell Science. 117, 3473-3480 (2004).
  5. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: from structure to function. Physiological Reviews. 82, 331-371 (2002).
  6. Heitzig, N., et al. Cooperative binding promotes demand-driven recruitment of AnxA8 to cholesterol-containing membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (4), 349-358 (2018).
  7. Drücker, P., Grill, D., Gerke, V., Galla, H. J. Formation and characterization of supported lipid bilayers containing phosphatidylinositol-4,5-biphosphate and cholesterol as functional surfaces. Langmuir. 30, 14877-14886 (2014).
  8. McConnell, H. M., Watts, T. H., Weis, M. R., Brian, A. A. Supported planar membranes in studies of cell-cell recognition in the immune system. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Biomembranes. 864, 95-106 (1986).
  9. Anderson, T. H., et al. Formation of supported bilayers on silica substrates. Langmuir. 25, 6997-7005 (2009).
  10. Pfeiffer, L., Petronis, S., Koper, I., Kasemo, B., Zach, M. Vesicle adsorption and phospholipid bilayer formation on topographically and chemically nanostructured surfaces. Journal of Physical Chemistry B. 114, 4623-4631 (2010).
  11. Cho, N. J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: a comparative study on silicon oxide and titanium oxide. Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).
  12. Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. J. Self-Assembly formation of lipid bilayer coatings on bare aluminium oxide: overcoming the force of interfacial water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).
  13. Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta(BBA) – Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
  14. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of lipid vesicle deposition on solid surfaces: a combined QCM-D and AFM study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Sauerbrey, G. Verwendung von Schwingquarzen zur Wägung dünner Schichten und zur Mikrowägung. Zeitschrift für Physik A Hadrons and Nuclei. 155 (2), 206-222 (1959).
  17. Rodahl, M., Höök, F., Krozer, A., Brzezinski, P., Kasemo, B. Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3924-3930 (1995).
  18. Drücker, P., Pejic, M., Grill, D., Galla, H. J., Gerke, V. Cooperative binding of annexin A2 to cholesterol-and phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate-containing bilayers. Biophysical Journal. 107 (9), 2070-2081 (2014).
  19. Galic, M., et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  20. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).
  21. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  22. Bianco, M., et al. Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics. Biotechnology Journal. , 1700699 (2018).
  23. Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond. Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).
  24. Bragazzi, N. L., et al., Donev, R., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. 101, 149-211 (2015).

Tags

Dissipative MicrogravimetryPhospholipid Binding ProteinAnnexin A2Solid-supported Lipid BilayersQuartz ResonatorCalcium-dependent BindingNegatively Charged PhospholipidsLabel-freeSensitiveQuantitativeReal-time AnalysisLipid SolutionsMultilamellar VesiclesSmall Unilamellar VesiclesSDS CleaningPlasma Cleaning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Matos, A. L. L., Grill, D., Kudruk, S., Heitzig, N., Galla, H., Gerke, V., Rescher, U. Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator. J. Vis. Exp. (141), e58224, doi:10.3791/58224 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image