ここでは、結合親和性と固定化固相担膜 (SLB) と A2 を同時に測定することによりアネキシン ラベル無料リン脂質結合蛋白質の相互作用のモードを決定するために用いることができる実験的プロトコルを提案する、質量吸収とアネキシン A2 蛋白質の粘弾性特性。
散逸水晶振動子微量天秤法が同時に相互作用の測定が可能、センサー表面の吸収固定化質量の質量吸収および粘弾性特性を測定する簡単なラベル無料アプローチタンパク質などリアルタイムでの脂質二重膜の固相担面と高い感度を有する。アネキシンは、カルシウム イオンの調整を介して負荷電の headgroups を可逆的操作リン脂質結合蛋白質の非常に節約されたグループです。ここでは、A2 をアネキシンの結合を定量的に解析する採用されたプロトコルについて述べる (AnxA2) 水晶振動子センサーの表面上に作製した平面脂質二重膜に。このプロトコルは、堅牢かつ再現性のあるデータを取得するように最適化し、詳細な説明が含まれています。このメソッドは、他の膜結合タンパク質と二分子膜組成に適用できます。
細胞膜は、非常にダイナミックで複雑な構造です。末梢および/または一体に関連する膜蛋白質と脂質の化合物の混合物は、フォーム ミクロ相分離構造を組み立てます。これら膜ミクロ ドメインの協調空間組織は重要な生理的過程1で関与しています。膜創製の原動力は、周辺膜蛋白質を認識し、脂質、ミクロ相分離構造の濃縮と対話の能力によってと同様、膜脂質の相互作用によって駆動されています。特定の脂質をタンパク質の募集は頻繁に脂質認識モジュールを介して達成、プレクストリン相同性 (PH) や C2 ドメイン2,3など。モデル膜の生物物理学的分析法は、分子レベルでこれらのプロセスを管理する基本原則を理解するための鍵です。
大規模な多遺伝子発現解析-家族、アネキシン負荷電膜脂質、ホスファチジルセリン (PS)、主に Ca2 +でバインドする能力で知られている-方法2を制御します。アネキシンの家族の第 2 の特徴は保存された構造のセグメントの存在、つまり現在の 4 または 8 回し、Ca2 +– とリン脂質の結合サイト4港湾を繰り返す、アネキシンします。Ca2 +-依存脂質膜相互作用を感知し、Ca2 +を伝えるための最適なポジションに、アネキシンの場所-ターゲット膜へのシグナリングを仲介します。一貫して、アネキシンがコレステロール、ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸 (PI (4, 5) P2) と PS、携帯電話および/または人工膜システム5の両方を豊かにミクロ相分離構造の形成を誘導することができます。このプロトコルでは、水晶振動子微量天秤散逸 (QCM-D)6,7、8を使用してアネキシン膜の相互作用を分析する方法について説明します。
この天秤の基本的なコンポーネントは、センサーの表面として機能する振動結晶です。吸着および/またはセンサーの表面に分子の結合量の増加に比例して共振周波数 (f) が減少します。フィルム表面は均等に、追加物質の結合は、この層の構造の整合性と干渉するかもしれないし、粘弾性 (エネルギー損失係数 D) におけるこのような変更をまた監視できます。これは脂質とタンパク質の相互作用を研究する広範な技術です。このアプローチで脂質ベシクルは適切にコーティングされたセンサーの表面に吸収されます。脂質二分子膜の形成は、小胞が多いと他の親水性の表面で破裂しない石英材料9,10、有利な金11酸化アルや TiO2の12、UV オゾン暴露後のよう2O313。合体の小胞の破裂は、質量と放熱特性変化につながる水相を解放します。固相担 (SLB) 膜小胞の融合によっての世代はシンプルで堅牢、細胞膜を模倣する複雑なモデルを生成するために使用できます。
散逸の水晶振動子は、無料のラベル、機密性の高い手法です。最大の利点は、このように多様な研究分野でのアプリケーションの広い範囲を提供する表面に十分に薄膜を生成する任意の材料をコートする可能性です。膜タンパク質の相互作用を観察、リアルタイムと結果を直接分析することができます。(後で最小限の洗浄で行うこのプロトコルで記述されている)、その後の測定で同じセンサーの表面を使用ことができますこのように正確な内部統制および検体間の比較可能性を可能にします。
定量的および定性的な両方細胞膜の構造と機能の関係に関する質問に答えるため生物物理アプローチの使用から非常に細胞生物学利益確立に基づいて、広く技術を使用、原子を含む力の顕微鏡 (AFM)、表面プラズモン共鳴 (SPR) と QCM-D 法がここに採用します。アネキシン タンパク質 Ca2 +の結合する前の研究で示した-高親和性固定化膜に依存する方法。周波数を使用して消費シフト第 7 倍音 (Δf7) これは検出感度と振動安定性の最良の妥協点を表すため。
この手法には、膜タンパク質間相互作用の定量的な説明ができます。膜への AnxA2 バインドは、保存されたアネキシン コア ドメインによって仲介される、コレステロールの存在に依存する正の協同性が特徴です。AnxA2 と AnxA8 に掲載されるために得られる定量的なデータは別の場所で6,8を詳しく説明します。
このプロトコルには多くの重要なステップがあります。すぐにリポソームを使用します。そうでなければ、小さな小胞は、脂質二分子膜形成の阻害につながる以下の表面張力より大きい小胞に溶けるでしょう。測定中に一定の温度を維持します。各温度のバラツキが少ないは、無視できない頻度と消費シフトの結果します。空気の泡を避けるためさもなければ、システムは安定して、ベースラインを確立しません。
Sauerbrey の同等化は、観測周波数の直接変換質量の変化に変更は、したがって、広く使用されることができます。ただし、共振周波数の変化と付加質量の線形相関の仮定はのみセンサー表面上剛性と均一な膜を形成するコンポーネントの場合は true を保持します。Sauerbrey の同等化は粘弾性吸着脂質層に取り込まれた水は、水が豊富なタンパク質フィルムなどには使用できませんまたは細胞をも吸着します。ここより複雑な数理モデルが必要です。したがって、非常に周波数や消費電力の変化を同時に監視することが重要です。測定の間に構造変化を検出するには、ΔD対Δf 比をプロットできます、構造変化がないことを示す直線と。
この手法の主な利点は、基板として材料の非常に広い範囲を使用する可能性が。また、表面コーティング膜 (SLB) などの適切な形成としてそれ以上のタンパク質-脂質相互作用だけでなく、高分子の相互作用の広い範囲を研究するための信頼性の高い直接法をオンラインで監視することができますです。
このプロトコルは、他の膜と相互作用するタンパク質など、適用ドメイン蛋白質19、バー膜骨格リンケージ20,21 で重要な役割を持っている ERM (モエシン、ラデキシン、エズリン) タンパク質ファミリー ,22、または C2 または PH ドメインを含むタンパク質。さらに、生物学的材料の研究にこの手法の適用の広い範囲が正常に公開されたより複雑な高分子アセンブリあるいは相互作用の研究に適して実験プラットフォームとして水晶振動子を確立23,24をセルします。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、ドイツ研究基金助成金 SFB 858/B04、EXC 1003、SFB 1348/A04、SFB 1348/A11 下によって支えられました。
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |