Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş
Summary
Retina pigment epitel hücrelerinin insan amniyotik membran ve hayvan modellerinde aşılama için hazırlık üstüne kültürlü insan pluripotent kök hücreler elde oluşan bir retina doku mühendisi bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Birkaç patolojik koşulları göz işlevselliği ve/veya retina pigment epiteli (RPE) yaşama etkiler. Bunlar bazı formlar retinitis pigmentosa (RP) ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) içerir. Hücre tedavisi zaten insanlarda ilk sonuçlar teşvik ile bu hastalıkların tedavisi için önerilen en umut verici tedavi stratejileri biridir. Ancak, greft hazırlanması yöntemi onun fonksiyonel sonuçlar içinde vivoüzerinde önemli bir etkisi vardır. Nitekim, RPE hücrelerinin hücre süspansiyon aşılı Retina bir doku nakli aynı hücreler daha az işlevsel. Burada, mühendis RPE doku ve onun hazırlık in vivo implantasyon için basit ve tekrarlanabilir bir yönteme açıklar. RPE hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerden türetilmiş bir biyolojik destek, insan amniyotik membran (hAM) numaralı seribaşı. Yapay iskele için karşılaştırıldığında, bu destek nerede endojen RPE hücrelerinin bağlı Bruch’ın membran yakın olan bir membran sahip olmanın avantajı var. Ancak, onun manipülasyon kolay değildir ve onun uygun kültür için çeşitli stratejiler ve hazırlık içinde vivoaşılama için geliştirdiğimiz.
Introduction
RPE çok hayatta kalma ve sıkı bir şekilde ilişkili1olduğu photoreceptors homeostazı için önemlidir. Birkaç patolojik koşulları, işlevsellik ve/veya hayatta kalma, RP ve AMD gibi değişiklikler.
RP photoreceptors veya RPE hücrelerinin ya da her ikisi2,3fonksiyonları etkiler devralınan monogenic mutasyonlar oluşan bir gruptur. Bu etkiler özellikle RPE mutasyonlar RP2%5 için hesap hücreleri tahmin edilmektedir. AMD nerede RPE katman değiştirilmez, başka bir lider sonuçta için merkezi görme kaybı durumdur. AMD tarafından genetik ve çevresel faktörlerin karmaşık etkileşimlerin neden olur ve yaşlı4,5,6etkiler. Projeksiyonlar göre AMD için 196 milyon hasta 20207tarafından Dünya çapında bir endişe olacaktır. Bu bozuklukları için etkili tedavisi yoktur var, ve bir teklif stratejileri yeni RPE hücrelerinin nakli ölü/işlevsiz önceden varolan RPE hücrelerinin8için telafi etmek için.
Aşılı için nihai ürün formülasyonu modu en iyi fonksiyonel sonuçları sağlamak için önemlidir. Teslimat, kolay ve basit bir yöntem olmasına rağmen bir hücre süspansiyon olarak enjekte RPE hücrelerinin endişeleri ile ilgili olarak onların hayatta kalma, tümleştirme ve işlevsellik9,10,11,12 yükseltmek , 13. bilim adamları artık daha fazla gelişmekte teslim etmek için karmaşık formülasyonları mühendislik Retina doku9,13,14,15,16. Bu bağlamda, ekimi9için kullanılabilir vitro RPE doku oluşturmak için özgün bir yöntem geliştirdik.
RPE hücre bankalar (ES) insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş bu protokol için kullanılır. Ancak, alternatif RPE hücre bankalar farklı hücre kaynaklarından (insan kaynaklı pluripotent kök hücreler, birincil RPE hücrelerinin, vb) ve farklı bir yöntem ile Ayrıştırılan bu iletişim kuralı için uygundur. Yönlendirilmiş farklılaşma içermektedir sitokinler ve/veya küçük moleküller17,18,19,20,21,22kullanarak iletişim kuralları.
Nakledilecek, mühendislik doku üzerinde bir iskele hazırlanmalıdır. Son birkaç yıl içinde farklı iskele tabanlı bir polimer veya bir matris biyolojik kökenli13,23,24geliştirilmiştir. Burada, kullanılan biyolojik substrat jambon olmakla beraber denuded Bruch zarı gibi diğer yüzeylerde uygulanabilir. Burada açıklanan yöntemi daha RPE yerel ortam ile ilgili biyolojik bir iskele kullanmanın avantajı vardır.
İnsan ES Hücre kaynaklı RPE hücrelerinin en az 4 hafta için tam bir Arnavut kaldırımlı monolayer düzenlenmesi amacıyla kültürlü. Bu aşamada elde edilen epitel işlevseldir ve9polarize. Son olarak, bu doku kolayca kırışıklıkları gibi daha fazla sertlik ve esneklik vermek için ve enjeksiyon işlemi sırasında korumak için hidrojel taşıyıcı ince bir tabaka, gömülüdür. Bu ürün sonra aşılama kadar 4 ° C’de depolanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolojik bir iskele ve onun hazırlanması için implantasyon hayvan modellerinde RPE hücrelerinin kültürü için bir yöntem nitelendirdi. Bakım prosedürü boyunca jambon yönünün jelatin içine onun dahil kadar Protokolü’nün önemli adımlardan biri. Nitekim, membran yerli epitel kaldırılır ve onun membran maruz kalan9olur. RPE hücrelerinin üstünde tepe-in bu membran seribaşı zorunda. Jelatin katıştırma için hazırlık, tanımlanmış sıcaklığında iş ile tüm ürün ç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Jérôme Larghero ve Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, Paris, Fransa) ayarlama sırasında burada açıklanan yöntemin kendi giriş için teşekkür etmek istiyorum.
Bu eser ANR gelen hibe tarafından desteklenen [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [biyo-mühendislik programı – DBS20140930777] ve LABEX [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau ve Christelle Monville canlandırmak. O NeurATRIS, pluripotent için mühendislik translasyonel araştırma için bir altyapı (Investissements d’Avenir) biotherapies sinir [ANR-11-INBS-0011] ve INGESTEM, Ulusal altyapı (Investissements d’Avenir) tarafından desteklenen ve Christelle Monville için farklı kök hücre [ANR-11-INBS-000]. Karim Ben M’Barek DIM Stempole ve LABEX canlandırmak [ANR-10-LABX-73] arkadaş grupları tarafından desteklenmiştir. Kök Biotherapies Enstitüsü Nadir Hastalıklar Derneği Française contre les Myopathies (AFM) tarafından desteklenen bir parçasıdır-Téléthon.
Materials
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. Age-related macular degeneration–emerging pathogenetic and therapeutic concepts. Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).
- Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).
- Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. Age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ben M’Barek, K., Regent, F., Monville, C. Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies. World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).
- Ben M’Barek, K., et al. Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures. Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).
- Diniz, B., et al. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Thomas, B. B., et al. Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).
- Borooah, S., et al. Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Lustremant, C., et al. Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis. Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Ilmarinen, T., et al. Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium. PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).
- Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. Descemet’s membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation. Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).
- Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs. Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).
- Capeans, C., et al. Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).
- Ohno-Matsui, K., et al. The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation. Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).
- Paolin, A., et al. Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes. Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).
- Hu, Y., et al. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).
- Song, M. J., Bharti, K. Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling. Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).
- Ramsden, C. M., et al. Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future). Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration. Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Transplantation of the RPE in AMD. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
